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Please use this identifier to cite or link to this item: http://dx.doi.org/10.25673/3165
Title: Experimentelle Gentherapie bei malignen Tumoren des Zentralnervensystems
Granting Institution: Martin-Luther-Universität Halle-Wittenberg
Extent: Online-Ressource, Text + Image
Type: Hochschulschrift
Language: ger
Publisher: Niedersächsische Staats- und Universitätsbibliothek
Universitäts- und Landesbibliothek Sachsen-Anhalt
URN: urn:nbn:de:gbv:3-000003950
Keywords: Elektronische Publikation
Hochschulschrift
Gentransfer, liposomale Transfektion, Ultraschall (US), US-Kontrastmittel, Einkapselung, Alginat, Inotech EncapsulatorTM, AirJet, JetCutter
Zsfassung in engl. Sprache
gene transfer, liposome-mediated transfection, ultrasound (US), US contrast agent, encapsulation, alginate, Inotech EncapsulatorTM, AirJet, JetCutter
Abstract: Kationische Liposomen werden weit verbreitet als Vektoren zur Gentherapie genutzt, um Makromoleküle effizient in Säugerzellen zu übertragen. Ein wesentliches Ziel der vorliegenden Arbeit war die Charakterisierung eigens synthetisierter kationischer Liposomen, komplexiert mit Plasmid-DNA, die in Zellkultur von Hirntumorzellen (Gliome) unter serumfreien und serumhaltigen (in vivo ähnliche) Bedingungen getestet und optimiert wurden. Die Expression des Markergens EGFP wurde mittels Fluoreszenzmikroskopie und FACS-Analyse quantifiziert. Allgemein führten die Transfektionen unter serumhaltigen Bedingungen zu höheren Gentransferraten im Vergleich zu serumhaltigen Bedingungen. Konzentrationserhöhungen der Liposomen (10-30 nmol) und der Plasmid-DNA (1-10 µg) führten in serumfreiem Medium wie unter serumhaltigen Bedingungen zu keiner Transfektionssteigerung. Konzentrationen von 1 bis 10 nmol des kationischen Lipids bei jeweils gleichbleibender DNA-Konzentration resultierten dagegen in einer signifikanten Erhöhung der Markergenexpression. Da Ultraschall (US) den lipsomalen Gentransfer in eukaryontische Zellen unterstützt, wurde der Effekt eines 2 MHz fokussierten US (0,5 W/cm2) und des US-Kontrastmittels Levovist®, das in klinischen Anwendungen als US- Signalverstärkung genutzt wird, auf den Liposomen unterstützten DNA-Transfer untersucht. 60 Sekunden US führten zu den besten Transfektionsergebnissen. Um US-Reflexionen und Kavitationen in den Kulturplatten zu vermeiden, wurde eine gesondert angefertigte US- Absorptionskammer angewendet, in der keine signifikante Erhöhung der liposomalen Transduktionsraten durch US-Einwirkung zu verzeichnen war. Die Applikation von Levovist® während der US-Exposition führte wiederum zu einer signifikanten Verbesserung der Transfektion. Jedoch war dabei zu erkennen, dass die Viabilität der Zellen, denen Kontrastmittel während der Beschallung verabreicht wurde, deutlich geringer war im Vergleich zu den nichtbeschallten Kontrollzellen. Diese US-Studien lassen darauf schließen, dass Kavitationseffekte, die durch US hervorgerufen werden, die liposomal unterstützte Gentransfereffizienz in Tumorzellkulturen verbessern, aber gleichzeitig den Zelltod durch Membranschäden einleiten. Die Einkapselung stellt eine neue Methode zur Immunoprotektion genetisch veränderter Säugerzellen dar. Mikrokapseln werden zur Produktion von rekombinanten Proteinen, Hormonen und Wachstumsfaktoren eingesetzt. Dieses Projekt sollte die Einkapselung von Säugerzellen in kleine (vibrating nozzle, ii) Gasextrusion (AirJet) und iii) JetCutter. Die mechanische Stabilität der APA-Mikrokapseln und die Viabilität der eingekapselten Zellen wurde in Langzeitkultur untersucht. Mit den beschriebenen Methoden und Einkapselungstechniken konnten Mikrokapseln mit regelmäßigen Formen und durchschnittlichen Größen in vivo in einem Tierexperiment eingesetzt und es wurde gezeigt, dass die APA-Mikrokapseln intraarteriell in Fischer-Ratten injiziert werden konnten und die Mikrokapselmembranen blieben intakt.
Cationic liposomes (CL) are widely used as vectors for gene therapy, and are able to effectively introduce macromolecules into mammalian cells. The present study was aimed at chracterization of custom-made CL, complexed with plasmid DNA, in cell culture employing brain tumor cells (glioma), which were tested and optimized under serum-free and serum-containing (in vivo-like) conditions. Marker gene (EGFP) expression was quantified by intravital fluorescence microscopy and by FACS analysis. Serum-free conditions generally afforded higher transfection rates than serum-containing conditions. Increase of CL and plasmid DNA concentration, either under serum-free or serum- containing conditions didn't significantly influence transfection rates in the tested range (10-30 nmol liposomes and 1-10 µg DNA). Additionally, transfection experiments with increasing liposome concentrations in the range of 1-10 nmol and constant DNA concentration resulted in significant improvement of marker gene expression under serum-free and serum-containing conditions. Recently, ultrasound (US) was reported to enhance liposome-mediated gene transfer in cell culture. Further experiments were undertaken to investigate the effects of low-frequency US (2 MHz, 0.5 mW/cm2) and the effect of the US contrast agent (CA) Levovist®, which is clinically used to enhance US echo signals, on liposome-mediated DNA transfection in culture. Application of US for 60 seconds yielded the strongest transfection enhancement. To eliminate US reflection and cavitation effects in the flat-bottom wells, a custom-made US absorption chamber was used. Unlike the previous experiment, US treatment in this setting didn't have any significant effects on liposomal transfection efficiency. In turn, application of Levovist® resulted in an increase of transfection rates. Cell viability with US and CA was much lower than in non-US-treated control cells. This study suggest that cavitation effects caused by US may enhance liposome-mediated DNA transfection efficiency in tumor cell culture, but also cause cell death by membrane damage. Microencapsulation is a novel method for immunoprotection of genetically engineered mammalian cells. Microcapsules are used as miniature bioreactors for long term production of recombinant proteins, hormones, and growth factors. This study aimed at optimizing alginate/poly-L-lysine/alginate (APA) microencapsulation of mammalian cells in small size microcapsules (in vivo in an animal model. APA microcapsules could be injected into the carotid artery of Fisher rats and the membranes of the microcapsules remained completely stable.
URI: https://opendata.uni-halle.de//handle/1981185920/9950
http://dx.doi.org/10.25673/3165
Appears in Collections:Hochschulschriften bis zum 31.03.2009

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