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Please use this identifier to cite or link to this item: http://dx.doi.org/10.25673/3167
Title: Modulation des L-Argininstoffwechsels von humanen dermalen mikrovaskulären Endothelzellen (HDMEC)
Granting Institution: Martin-Luther-Universität Halle-Wittenberg
Type: Hochschulschrift
Language: ger
Publisher: Niedersächsische Staats- und Universitätsbibliothek
Universitäts- und Landesbibliothek Sachsen-Anhalt
URN: urn:nbn:de:gbv:3-000004038
Keywords: Elektronische Publikation
Hochschulschrift
Dermale mikrovaskuläre Endothelzellen, CD31, Vasodilatation, Stickstoffmonoxid, L-Arginin, L-Ornithin, L-Lysin, y+ Transport, eNOS, iNOS, Tetrahydrobiopterin
Zsfassung in engl. Sprache
Dermal microvascular endothelial cells, CD31, vasodilatation, nitric oxide, L-arginine, L-ornithine, L-lysine, y+ transport, eNOS, iNOS, tetrahydrobiopterin
Abstract: Die Zellen des mikrovaskulären Gefäßsystems spielen bei physiologischen und pathologischen Prozessen eine wesentliche Rolle. Sie sind maßgeblich an der Initiation und Unterhaltung von Entzündungsreaktionen beteiligt. Stickstoffmonoxid (NO) agiert dabei als autokriner und parakriner Mediator bei der inter- und intrazellulären Kommunikation zwischen den verschiedenen Zellsystemen. NO ist außerdem fest involviert in die kutane aktive Vasodilatation der Haut. Es existieren eine Vielzahl von Kenntnissen zur Regulation der NO-Generierung in humanen makrovaskulären Endothelzellen, aber über die zelluläre Kontrolle der NOS in mikrovaskulären Endothelzellen ist wenig bekannt. Die vorliegende Arbeit soll mögliche Regulationsmechanismen des L-Arginin/NO-Stoffwechsels in humanen dermalen mikrohämovaskulären Endothelzellen (HDMEC) aufzeigen. Im Mittelpunkt der durchgeführten Untersuchungen stand einerseits die Verfügbarkeit der kationischen Aminosäure L-Arginin, dem natürlichen Substrat der NO-Synthase sowie der an der Enzymkatalyse beteiligten Cofaktoren (Tetrahydrobiopterin, Calzium/Calmodulin). Andererseits war es das Ziel der Untersuchungen, die Expression der endothelialen und der induzierbaren Stickstoffmonoxidsynthase (eNOS bzw. iNOS) in HDMEC zu analysieren. Die Untersuchungen zeigten, daß die Applikation von L-Arginin im nichttoxischen Konzentrationsbereich (bis 25 mM) keine Stimulation der NO-Freisetzung hervorrief. Kennzeichnend für die eNOS ist die Abhängigkeit der Aktivität vom intrazellulär verfügbaren Calzium/Calmodulin-Komplex. Es wurde vermutet, daß extrazellulär zugeführtes Ca2+ in die Zellen gelangt und somit eine Aktivitätssteigerung verursacht. Es konnte nur eine geringe Steigerung der NO-Produktion mit 2 mM CaCl2 nach 72 h Inkubation detektiert werden. Der Einsatz des essentiellen Cofaktors Tetrahydrobiopterin (BH4) führte nach einer 24stündigen Inkubation (25 µM-500 µM) zu einer konzentrationsabhängigen Zunahme der NO-Produktion. Der Transport von L-Arginin erfolgt zu 60 - 80% über das y+-System, durch das außerdem die kationischen Aminosäuren L-Ornithin und L-Lysin die Zellmembran passieren. Die Inkubation mit L-Ornithin bzw. L-Lysin (jeweils 2 mM) verminderte die NO-Freisetzung in den HDMEC. Die simultane Applikation von L-Ornithin + L-Arginin bzw. L-Lysin+L-Arginin hatte zur Folge, daß der inhibierende Effekt von L-Ornithin und L-Lysin hinsichtlich der NO-Produktion durch L-Arginin aufgehoben wurde. Mit Hilfe der RT-PCR wurde die Expression der endothelialen NOS (eNOS) und der induzierbaren NOS (iNOS) in HDMEC untersucht. Es konnten sowohl die eNOS als auch die iNOS in HDMEC nachgewiesen werden. Die Inkubation mit unterschiedlichen L-Argininkonzentrationen bewirkte eine Steigerung der Transkription der iNOS-Gene in HDMEC. Dieser Effekt trat nur nach der 24stündigen Behandlung auf. Somit kann zusammengefaßt werden, daß eine Modulation des L-Arginin/NO-Stoffwechsels in humanen dermalen mikrovaskulären Endothelzellen unter in vitro Bedingungen möglich ist und die Daten weitere Hinweise zur Regulation der NO-Produktion und dessen Funktion in Prozessen der Vasodilatation in humanen kutanen Gefässen liefern.
Cells of the microvascular vessel system play an important role in physiological and pathophysiological processes. They are involved in the initiation and maintenance of inflammatory reactions. Nitric oxide (NO) acts as an autocrine and paracrine mediator in the inter- and intracellular communication between various cell systems. NO is also involved in cutaneous active vasodilatation in the skin. Although an abundance of knowledge exists about the regulation of NO release in human macrovascular endothelial cells, only little is known about the cellular control of NOS in microvascular endothelial cells. In the present study we set out to demonstrate possible regulatory mechanisms of L-arginine/NO-pathway in human dermal microvascular endothelial cells. In the centre of investigations was on the one hand, the availability of the cationic amino acid L-arginine, the natural substrat of NO synthase and also the cofactors, tetrahydrobiopterin and calcium/calmodulin which are essential for enzym catalyse. On the other hand, the aim of the study was to analyse the expression of endothelial and inducible nitric oxide synthase (eNOS and iNOS) in HDMEC. The results show that application of L-arginine at non-toxic concentrations (up to 25 mM) does not lead to a stimulation of NO release. The dependence of the enzyme activity on the intracellular availability of calcium/calmodulin-complex is a typical feature of the eNOS. We supposed, that extracellulary added Ca2+ enters the cells and therefore causes an increase of activity. Only a slight increase of NO production following an treatment with 2 mM CaCl2 (72 h) could be shown. The application of the essential cofactor tetrahydrobiopterin (BH4) led to a concentration dependent increase of NO production after 24 h incubation. Furthermore, 60 - 80% of the transport of L-arginine occurs via the y+ system, which also transports the cationic amino acids, L-ornithine and L-lysine. An incubation with these amino acids (each 2 mM) decreased the NO release of HDMEC. Following the simultaneous application of L-ornithine plus L-arginine or L-lysine plus L-arginine, the inhibitory effect of L-ornithine or L-lysine with regards to NO production was reduced by L-arginine. In addition, using RT-PCR we investigated the expression of endothelial and inducible nitric oxide synthase in HDMEC on mRNA level. It could be shown that microvascular endothelial cells express as well eNOS as iNOS. The application of various L-arginine concentrations caused an increase of transcription of iNOS genes. This effect appeared only after 24 h. Finally it can be concluded, that a modulation of L-arginine/NO pathway in human dermal microvascular endothelial cells was possible in vitro, and the present results give further indications about the regulation of nitric oxide production and its function in the vasodilatory processes in human cutaneous vessels.
URI: https://opendata.uni-halle.de//handle/1981185920/9952
http://dx.doi.org/10.25673/3167
Appears in Collections:Hochschulschriften bis zum 31.03.2009

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