Strukturelle und funktionelle Charakterisierung der Ligandenbindungsdomäne des humanen GLP-1 Rezeptors

Abstract

GLP-1 (glucagon-like peptide-1) ist ein Peptidhormon, dass von Dünndarm freigesetzt wird und die Ausschüttung von Insulin im Pankreas verursacht. Die Insulin-freisetzende Wirkung von GLP-1 ist von der Blutglukosekonzentration abhängig, so dass die exogene Zufuhr von GLP-1 keine Hypoglykämie induzieren kann. Diese Tatsache zeichnet GLP-1 als einen potenziellen Einsatzstoff zur Behandlung von Typ-II-Diabetes (Non-Insulin-Dependent-Diabetes-Mellitus (NIDDM)) aus. Aufgrund seiner Instabilität im Blutplasma ist die Synthese von stabilen GLP-1 analogen Peptiden wünschenswert. Um noch bessere und wirksamere GLP-1-Analoga zu entwickeln, bedarf es nicht nur Untersuchungen auf der Peptidebene sondern auch einer genauen Charakterisierung der molekularen Wechselwirkung zwischen dem GLP-1 und seinem Rezeptor. GLP-1 Rezeptor gehört zur Klasse B der G-Protein gekoppelten Rezeptoren mit sieben Transmembranhelizes, zu der auch Rezeptoren für Peptidhormone wie Parathormon, VIP (vasoactive intestinal peptide), Calcitonin oder PACAP (pituitary adenylate cyclase activating peptide) gehören. Diese Rezeptoren zeichnen sich durch eine relativ lange N-terminale extrazelluläre Domäne, die in der Ligandenbindung involviert ist und sechs konservierte Cysteinreste besitzt. Das Ziel der Arbeit war eine Methode zur Herstellung von großen Mengen der isolierten N-terminalen extrazellulären Domäne der humanen GLP-1 Rezeptors für strukturelle und funktionelle Untersuchungen zu entwickeln. Die Rezeptordomäne wurde in E. coli in Form von Inclusion Bodies überexpremiert. Mittels Renaturierung und Aufreinigung über Ionenaustauschchromatographie und Gelfiltration konnte das Protein in löslicher und aktiver Form isoliert werden. Die Interaktion der isolierten Domäne mit seinem Ligand wurde mittels Cross-Linking-Experimente, Oberflächenplasmonresonanzmessungen und Isothermaler Titrationskalorimetrie nachgewiesen. Die Analyse der Disulfidverbrückung der Rezeptordomäne identifizierte das Vorhandensein von 3 Disulfidbrücken zwischen Cys46 und Cys71, Cys62 und Cys104 und zwischen Cys85 und Cys126.

The peptide hormone GLP-1 (glucagon-like peptide-1) is secreted by the duodenum, which subsequently triggers the release of insulin from pancreatic cells. The ability of GLP-1 to induce insulin secretion in dependence on high glucose levels, renders this component potentially useful in the treatment of non-insulin dependent diabetus mellitus (NIDDM). However, the peptide nature of GLP-1 prevents its direct application due to its short half-life in vivo. A rational design of new agonists will therefore greatly benefit from structural knowledge of the interaction between GLP-1 and its receptor. The receptor protein for GLP-1 belongs to class B of G-protein coupled receptors. The protein has a large N-terminal extracellular domain that was shown to be involved in the ligand binding. As for other peptide-hormone receptors such as receptors for parathyroid hormone (PTH), vasoactive intestinal peptide (VIP), calcitonin or pituitary adenylate cyclase activating peptide (PACAP), the N-terminal domain contains six conserved cysteine residues, which are assumed to form three disulfide bonds. As the extracellular domain of the GLP-1 receptor can specifically bind its peptide, we set out to generate large amounts of that portion of the molecule for functional and structural analysis The N-terminal, extracellular domain of the receptor for glucagon-like peptide 1 (GLP-1 receptor) was expressed at a high level in E. coli and isolated as inclusion bodies. Renaturation with concomitant disulfide bond formation was achieved from guanidinium-solubilized material. A soluble and active fraction of the protein was isolated by ion exchange chromatography and gel filtration. Complex formation with GLP-1 was shown by cross-linking experiments, surface plasmon resonance measurements, and isothermal titration calorimetry. The existence of disulfide bridges in the N-terminal receptor fragment was proven after digestion of the protein with chymotrypsin. Further analysis revealed a disulfide-binding pattern with links between cysteines 46 and 71, 62 and 104, and between 85 and 126.