Abhängigkeit der Inositol-(1,4,5)-triphosphat-Konzentration von Prolylendopeptidase - Ein neuer molekularer Mechanismus zur Erklärung des Einflusses von Prolylendopeptidase-Inhibitoren auf seelische und neurodegenerative Erkrankungen

Abstract

Prolylendopeptidase (PEP), eine Prolin-spezifische Endopeptidase hydrolysiert in vitro eine Anzahl von Neuropeptiden wie Substanz P und Arginin-Vasopressin. Weiterhin zeigen PEP-Inhibitoren positive Effekte auf Lern- und Gedächtnisprozesse. Auf Grund dieser Tatsachen wird vermutet, daß PEP an der in vivo-Modifikation von Neuropeptiden beteiligt ist. Dies würde aber eine extrazelluläre Lokalisation voraussetzen. Das Ziel der vorliegenden Arbeit war es, die molekularen Grundlagen der PEP-Inhibitor-vermittelten Effekte auf Lern- und Gedächtnisprozesse zu untersuchen. Dazu wurden die subzelluläre Lokalisation von PEP sowie der Einfluß von PEP-Inhibitoren auf Signaltransduktionsprozesse in humanen neuronalen und glialen Zellinien untersucht. In der vorliegenden Arbeit konnte gezeigt werden, daß PEP in humanen neuronalen und glialen Zellinien ausschließlich zytosolisch lokalisiert ist. Mit Hilfe der EGFP-Fusionstechnik und eines neu etablierten monoklonalen Anti-PEP Antikörpers konnte nachgewiesen werden, daß PEP in einer hohen Konzentration um den Zellkern herum vorkommt. Kolokalisationsstudien haben gezeigt, daß die Verteilung von PEP fast vollständig mit der des Tubulins übereinstimmt. Mit Hilfe von PEP-anti-sense-Zellinien sowie mit spezifischen PEP-Inhibitoren konnte gezeigt werden, daß die Verringerung der PEP-Expression bzw. die vollständige Inhibierung von PEP zu einer Erhöhung der IP3-Konzentration führt. Weiterhin kommt es zu einer Verstärkung des Substanz P-vermittelten IP3-Signals gegenüber Wildtypzellen. Dagegen konnte kein Einfluß von PEP auf die Adenylat-Cyclase-Kaskade festgestellt werden. Die vorliegenden Ergebnisse zeigen, daß durch intrazelluläre Interaktionen von PEP Neuropetid-vermittelte Signalprozesse via Phosphoinositidkaskade beeinflußt werden können, ohne direkt die Bioaktivität der Neuropeptide zu modulieren.

Prolyl endopeptidase (PEP) is a proline-specific oligopeptidase which, in vitro, is be able to rapidly degrade several neuropeptides, including Substance P and arginine-vasopressin, by limited proteolysis. Furthermore PEP inhibitors work as cognitive enhancers in different animal models. It has been hypothesized that these effects are due to modulation of neuropeptide bioactivity by PEP. But the interaction between the neuropeptides and their receptors takes place on the cell surface. The aim of this work was to investigate the molecular basis of the reported positive effects of PEP inhibitors on learning and memory as well as on neurotoxicity. The first part of this work includes the investigation of the subcellular localization of PEP in human neuronal and glial cell lines. The second part deals with the influence of PEP inhibitors on signal transduction processes. In the present work we could shown that PEP is exclusively localized in the cytosol of human neuronal and glial cell lines. Subcellular localization studies by using a newly established anti-PEP monoclonal antibody and a EGFP-fusion technique showed that PEP is mainly localized in the perinuclear space, more than in the cell periphery. Colocalization studies have been shown that PEP almost completely colocalized with tubulin cytoskeleton structures. Using antisense cell lines with reduced PEP expression as well as specific inhibitors, we were able to show an inverse correlation between Ins(1,4,5)P3 concentration and PEP activity. Furthermore, antisense cell lines and cells treated with a PEP inhibitor showed an amplified Ins(1,4,5)P3 signal after Substance P stimulation. All data presented, strongly suggest an indirect involvement of PEP in second-messenger pathways by intracellular interactions with potential cross-talk to signal transduction mediated by neuropeptides.