Molekularbiologische und biochemische Untersuchungen zur NO-unabhängigen Aktivierung der löslichen Guanylatcyclase

Abstract

Die lösliche Guanylatcyclase (sGC), ein Heterodimer aus einer alpha- und einer Häm-bindenden β-Untereinheit, ist der wichtigste Rezeptor für das gasförmige Signalmolekül Stickstoffmonoxid (NO). NO führt durch die Bindung an die prosthetische Hämgruppe des Enzyms zur Aktivierung der sGC. Als eines der Schlüsselenzyme des NO-Signalweges ist die sGC an einer Vielzahl unterschiedlicher physiologischer Mechanismen beteiligt, wie z.B. der Neurotransmission, der Plättchenaggregation oder der Relaxation der Blutgefäße. Die Pathogenese verschiedener Krankheiten (vor allem im kardiovaskulären Bereich) konnte mit einer unzureichenden Aktivierung der sGC in Verbindung gebracht werden. Ein Wirkstoffklasse, die in diese Signalkaskade eingreift sind die NO freisetzenden organischen Nitrate, welche seit über 100 Jahren zur Behandlung der Angina pectoris eingesetzt werden. Aufgrund einiger Nachteile der organischen Nitrate wurde seit einigen Jahren nach Verbindungen gesucht, welche die sGC unabhängig von NO aktivieren. Mit BAY 41-2272 und BAY 41-8543 konnte eine Wirkstoffklasse entwickelt werden, welche die sGC in einer NO-unabhängigen aber Häm-abhängigen Weise aktiviert. Neben diesen mittlerweile gut charakterisierten Häm-abhängigen sGC-Stimulatoren konnte mit BAY 58-2667 vor kurzem eine weitere Klasse NO-unabhängiger sGC-Aktivatoren identifiziert werden. Diese Wirkstoffklasse aktiviert die sGC, im Gegensatz zu BAY 41-2272 und BAY 41-8543, unabhängig von der Präsenz der prosthetischen Hämgruppe. In der hier vorliegenden Arbeit sollte der Wirkmechanismus dieser neuen Klasse NO- und Häm-unabhängiger sGC-Aktivatoren untersucht werden. Es konnte gezeigt werden, dass BAY 58-2667, im Gegensatz zu NO, nicht am Eisenzentrum der prosthetischen Hämgruppe angreift. Trotzdem führt BAY 58-2667, ebenso wie NO, zu einer Erhöhung der maximalen katalytischen Aktivität des Enzyms. Durch Rezeptorbindungsstudien konnte gezeigt werden, dass die Häm-abhängigen sGC-Stimulatoren sowie die Häm-unabhängigen sGC-Aktivatoren verschiedene Bindungsstellen besitzen. Für BAY 58-2667 wurde eine hochaffine Bindung an die sGC mit einem KD-Wert im nanomolaren Bereich gezeigt. Darüber hinaus ergaben die Bindungsversuche Hinweise auf eine mögliche zweite Bindungsstelle für BAY 58-2667 an der sGC. Die erste putative Bindungsstelle für BAY 58-2667 konnte durch ein Photoaffinitätslabeling mit dem Tyrosin 371 der alpha- und im Bereich der Aminosäuren 231-310 der beta-Untereinheit der sGC in Verbindung gebracht werden. Die zweite Bindungsstelle für BAY 58-2667 konnte in der Häm-Bindungstasche des Enzyms lokalisiert werden. Dabei konnten mit dem Tyrosin 135 und dem Arginin 139 der beta-Untereinheit der sGC die bereits vor zwei Dekaden postulierten Ankeraminosäuren der prosthetischen Hämgruppe identifiziert und eine direkte Kompetition zwischen BAY 58-2667 und der Hämgruppe um diese Aminosäuren nachgewiesen werden. Die weitreichende Aufklärung der Interaktion zwischen BAY 58-2667 und der sGC eröffnet die Möglichkeit einer gezielten Synthese weiterer NO- und Häm-unabhängiger sGC-Aktivatoren. Diese Verbindungen könnten die klassischen NO-Donoren vom Typ der organischen Nitrate ersetzen und so eine Basis für neue, nebenwirkungsärmere Ansätze bei der Therapie kardiovaskulärer Erkrankungen liefern.

Soluble guanylate cyclase (sGC), an intracellular receptor for the ubiquitous biological messenger nitric oxide (NO), is a heterodimer consisting of an alpha- and a heme-containing beta-subunit. Activation of the enzyme upon binding of its physiological activator NO to the heme moiety catalyzes the conversion of GTP to the second messenger cGMP. cGMP regulates various effector systems such as phosphodiesterases, ion channels and protein kinases, thereby modulating many physiological processes including vasodilatation, neurotransmission and platelet aggregation. The pathogenesis of various diseases, especially those of the cardiovascular system, has been linked to inappropriate activation of sGC. The concept of NO-dependent sGC activation as a mechanism underlying antianginal action has been validated by the successful clinical use of NO-releasing drugs for more than a century. Recently, a novel class of NO-independent sGC-stimulators has been identified. These compounds, BAY 41-2272 and BAY 41-8543, stimulate sGC in a NO-independent manner but require the presence of the prosthetic heme moiety. Therefore, these compounds were termed NO-independent but heme-dependent sGC-stimulators. In contrast to these compounds, another very recently identified non-NO-based sGC activator BAY 58-2667 stimulates not only the native sGC but, even more potently, the heme-deficient or oxidized form of the enzyme suggesting a novel mechanism of activation. In the present work the activation mechanism of this novel NO- and heme-independent sGC-activator was investigated. It could be shown that in contrast to NO, BAY 58-2667 does not directly interact with the iron of the prosthetic heme moiety. However, BAY 58-2667 activates the enzyme, like NO, by increasing the maximum catalytic rate. Receptor binding studies indicated that the heme-dependent sGC-stimulators and the heme-independent sGC-activators bind to different independent binding sites at the sGC. For BAY 58-2667 a KD value within nanomolar concentrations was determined. In addition, receptor binding studies suggested the existence of two binding sites for BAY 58-2667 at the sGC. For the first putative binding site an involvement of the tyrosine 371 of the alpha- and the amino acids 231-310 of the beta subunit in the binding of BAY 58-2667 was suggested by a photoaffinity labeling approach. The second putative binding site was localized within the heme binding pocket of sGC. Thereby, the amino acids tyrosine 135 and arginine 139 of the beta subunit of sGC were identified as the anchoring residues of the heme moiety postulated 20 years ago. In addition, a direct competition between BAY 58-2667 and the heme ligand for these two residues could be shown indicating that BAY 58-2667 replaces the native sGC heme moiety. This replacement results in the release of the axial heme ligand histidin 105 and in the subsequent activation of the enzyme. This far-going explanation of the molecular mechanism of the BAY 58-2667-induced enzyme activation will be useful for the synthesis of further NO- and heme-independent sGC-activators. This compounds may replace the organic nitrates nitrates and offer a new approach for treating cardiovascular diseases.