Die Deadenylierung von mRNAs durch den CCR4/NOT-Komplex in Saccharomyces cerevisiae und Drosophila melanogaster

Abstract

Die Genexpression hängt von der Transkriptmenge ab, die durch das Verhältnis von Transkription und mRNA-Abbau reguliert wird. Deadenylierung ist meist der einleitende und oft auch der geschwindigkeitsbestimmende Schritt des mRNA-Abbaus. In dieser Studie konnte der CCR4/NOT-Komplex, in dem zwei Untereinheiten, Ccr4p und Pop2p, Homologie zu Exonukleasen aufweisen, als die vorherrschende deadenylierende Aktivität in S. cerevisiae identifiziert werden. In pop2-Deletionsstämmen wurde eine Verlängerung der Gesamt-Poly(A)-Schwänze beobachtet. Der Komplex wurde mittels der TAP-tag Methode isoliert und zeigte poly(A)-spezifische 3'-Exonukleaseaktivität in vitro. Homologe zu fast allen Untereinheiten des Komplexes konnten ebenfalls im Genom von D. melanogaster identifiziert werden. Durch biochemische Fraktionierung von cytoplasmatischem S2-Extrakt wurde gezeigt, dass die beiden wahrscheinlich katalytischen Untereinheiten CAF1 und CCR4 mit einer poly(A)-spezifischen 3'-Exonukleaseaktivität assoziiert sind. Der knock-down von fast allen Untereinheiten des CCR4/NOT-Komplexes durch RNAi führte auch in D. melanogaster-S2-Zellen zu verlängertem Gesamt-Poly(A). Bei einem knock-down von CAF1 konnte auch ein Einfluss auf die Deadenylierung der Hsp70-mRNA während der Erholung von einem Hitzeschock beobachtet werden.

The rate of synthesis of any protein depends primarily on the amount of the corresponding mRNA present in the cell. The amount of mRNA is controlled by the rates of both synthesis and degradation. The first step of the main pathway of mRNA degradation in eukaryotes is the removal of the poly(A) tail by a 3'to 5'exonuclease, a process termed deadenylation. Deadenylation can be the rate limiting step of the whole mRNA degradation process. In this study the CCR4/NOT complex has been identified to bear the major enzymatic activity catalyzing mRNA deadenylation in S. cerevisiae. Two of its subunits, Pop2p (= CAF1) and Ccr4p, show homology to exonucleases and deletion of Pop2p resulted in elongated bulk poly(A) in the mutant yeast cell. The complex has been purified using the TAP-tag method and showed poly(A) specific 3'exonuclease activity in vitro. Homologs for almost all subunits of this complex could also been identified in the Drosophila genome. Biochemical fractionation of cytoplasmic extract from Schneider 2 (S2) cells showed that the two likely catalytic subunits,CCR4 and CAF1, were associated with each other and with a poly(A)-specific 3' exonuclease activity. Individual knock-down of almost every potential subunit of the Drosophila CCR4/NOT-complex by RNAi in cultured S2-cells led to a lengthening of bulk mRNA poly(A) tails. Knock-down of CAF1 also interfered with the rapid deadenylation of Hsp70 mRNA during recovery from heat shock.