Identifizierung und Charakterisierung schwermetallregulierter Gene im Metallophyten Arabidopsis halleri (L.) und in Arabidopsis thaliana (L.)

Abstract

In der vorgestellten Arbeit wurden im Metallophyten Arabidopsis halleri nach der Behandlung mit Zn, Cd und Cu differenziell exprimierte Gene identifiziert und anschließend im nahe verwandten Modellsystem Arabidopsis thaliana molekular sowie funktionell charakterisiert. Insgesamt konnten mit Hilfe der cDNA-AFLP-Analyse in A. halleri 278 differentiell exprimierte Genfragmente identifiziert werden. Basierend auf den erhaltenen Genfragmenten wurde innerhalb der kodierenden Sequenz eine Sequenzidentität von 94,2 % zwischen A. halleri und A. thaliana ermittelt. Ein differentielles Expressionsmuster konnte für 19 Fragmente mit Hilfe von RT-PCR-Analysen und Makroarrays bestätigt werden. Drei cDNA-AFLP-Klone wurden weiter charakterisiert, die für mögliche Signaltransduktionskomponenten kodierten (bZIP-Transkriptionsfaktor bZIP6, Proteinphosphatase 2C, MAP-Kinase MPK11). Für alle untersuchten Klone wurden in beiden Arabidopsis-Spezies vergleichbare Expressionsmuster bestätigt. Um die mögliche Funktion von AtbZIP6 in der Schwermetallsignaltransduktion zu untersuchen, wurde eine homozygote T-DNA-Insertionslinie isoliert und unter Verwendung der bZIP6-1-Mutante Mikroarray-Hybridisierungsexperimente durchgeführt. Neben der transkriptionellen Aktivierung von AtMPK11 durch Metallionen wurde auch eine posttranslationale Aktivierung von MAP-Kinasen untersucht. Kupfer- und Cadmiumionen waren im Wurzelgewebe von A. thaliana in der Lage zwei MAP-Kinasen zu aktivieren. Mit Hilfe von spezifischen Antikörpern konnte eine MAP-Kinase als AtMPK6 identifiziert werden.

In the present thesis differentially regulated genes from the metallophyte Arabidopsis halleri exposed to Zn, Cd and Cu were identified. For further molecular and functional studies the closely related model plant Arabidopsis thaliana was used. A total of 278 differentially regulated fragments could be identified by cDNA-AFLP analysis. On the basis of the isolated gene-fragments a sequence-identity between A. halleri and A. thaliana in the coding sequence of 94.2 % was determined. The differential expression pattern could be confirmed for 19 fragments by RT-PCR and macroarray-hybridization experiments. A further characterization was carried out for three cDNA-AFLP-clones, encoding for putative signaltransduction components (bZIP-transcription factor bZIP6, protein phosphatase 2C, MAP-kinase MPK11). A comparable expression pattern in both Arabidopsis species was confirmed. To examine a possible involvement of AtbZIP6 in metal-specific signaltransduction events a homozygous T-DNA-insertion line was isolated. With this bZIP6-1 mutant microarray-hybridisation experiments were carried out. In addition to the characterization of MPK11 on the transcript level, the posttranslational activation of MAP-kinases was analyzed. Both, copper and cadmium ions were able to activate two MAP-kinases posttranslationally in roots of A. thaliana. Using specific antibodies one of the MAP-kinases could be identified as AtMPK6.