Dynamic posttraumatic changes of monocyte subsets

Abstract

Die Überlebensrate von schwerverletzten PatientInnen verbesserte sich durch fortgeschrittene primäre Behandlungsalgorithmen, dennoch sind diese PatientInnen weiterhin anfällig für sekundäre Infektionen während ihres Krankenhausaufenthaltes. Infolge von einer traumatischen Verletzung wird eine proinflammatorische Immunantwort eingeleitet, deren Ausmaß und potenzielles Ungleichgewicht zu antiinflammatorischer Immunantwort trägt dazu bei, dass PatientInnen weiterreichende inflammatorische Komplikationen erleiden. Auf Grund dessen könnte die Analyse der Veränderungen von humoraler und zellulärer Immunantwort in schwerverletzten PatientInnen perspektivisch einen wichtigen therapeutischen Angriffspunkt darstellen. Im Gewebe ansässige Makrophagen, die zirkulierenden Monozyten und neutrophil Granulozyten leiten auf der zellulären Ebene die unverzügliche Immunantwort ein, womit sie sich auf die Reparaturprozesse des Gewebes und dem Schutz vor eindringenden Pathogenen beteiligen. Unfallbedingte Immunsuppression und die anschließende Entwicklung von Multiorganversagen wurden mit anomaler Funktionalität der Monozyten assoziiert. Die Änderungen des Phänotyps von Monozyten spielen eine wichtige Rolle bei verschiedenen Krankheitsbildern. Dazu gibt es keine Daten bei schwerverletzten PatientInnen. Hier wurde untersucht, wie sich der Phänotyp der Monozyten (klassische CD16-CD14bright, proinflammatorische ‚intermediate‘ CD16+CD14bright und nicht-klassische CD16+CD14low Monozyten) und deren antimikrobielle Aktivität in schwerverletzten PatientInnen innerhalb der ersten 12 Stunden nach dem Unfall ändert. Zusätzlich könnte die posttraumatische Behandlung wesentlich verbessert werden, wenn Zielmoleküle identifiziert würden, die den sekundären inflammatorischen Komplikationen entgegenwirken. Pulmonales Club-Zellprotein 16 (club cell protein 16; CC16) hat antiinflammatorische Eigenschaften. Abweichungen seiner Konzentration in der Lunge und im Blut sind mit verschiedenen Lungenerkrankungen assoziiert. Auf Grund dessen untersuchten wir die Bedeutung von CC16 auf die lokale und systemische Plastizität von Phänotypen der Monozyten und Makrophagen (proinflammatorische Ly6Cbright und antiinflammatorische Ly6Clow Monozyten und Makrophagen) und seine antiinflammatorische Wirkung in einem Mausmodell der früh manifesten unfallbedingten Sepsis. Dieses Modell bestand aus einer stumpfen Thoraxverletzung und anschließender Ligation und Punktion des Zäkums (cecal ligation and puncture; CLP). Unter Anderem sind bis zu 50% der in die Notaufnahme eingelieferten PatientInnen alkoholisiert, was zusätzlich das Risiko erhöht, eine sekundäre Infektion zu entwickeln. Eine akute Alkoholintoxikation geht mit einer Toll-like Rezeptor (TLR)4-Toleranz der Monozyten gegenüber Endotoxin und anschließender Herabregulation des NLRP3-Inflammasoms und der Sekretion von proinflammatorischen Zytokinen wie Interleukin-1β einher. Allerdings wurden dabei die unterschiedlichen Phänotypen der Monozyten noch nicht untersucht. Hierzu untersuchten wir im zeitlichen Verlauf den Einfluss von Rauschtrinken, einer der häufigsten Form des Alkoholmissbrauchs, auf die phänotypischen Änderungen der Monozyten und deren Aktivierung des NLRP3-Inflammasoms in gesunden ProbandInnen. Es konnte gezeigt werden, dass schwerverletzte PatientInnen einen signifikant erhöhten Anteil an proinflammatorischen CD16+CD14bright Monozyten (intermediate monocytes) aufweisen, wobei alle Phänotypen deutlich höhere Mengen von Sauerstoffradikalen (reactive oxygen species; ROS) produzieren. Eine ex vivo Stimulation mit Phorbol-12-myristat-13-acetat erhöht weiter die intrazellulären Levels von ROS, allerdings deutlich weniger in proinflammatorischen CD16+CD14bright und nicht-klassischen CD16+CD14low Monozyten (non-classical monocytes) verglichen mit Monozyten der gesunden ProbandInnen. Dies deutet darauf hin, dass Monozyten von schwerverletzten PatientInnen eine Hyporesponsivität gegenüber einem zweiten Stimulus haben könnten. Übereinstimmend induziert eine stumpfe Thoraxverletzung mit anschließender CLP den systemischen und lokalen Anstieg von proinflammatorischen Ly6Cbright gegenüber den antiinflammatorischen Ly6Clow Monozyten und Makrophagen. Intrapulmonale Neutralisation von CC16 vor CLP verstärkt diesen Effekt und führt zu weiterem Anstieg von Lungenschäden und proinflammatorischen Mediatoren Tumornekrosefaktor, Monozyten-chemoattraktives Protein 1 und Rezeptor für advanced glycation end-products. Zuletzt hat ein Alkoholintus von 1‰ einen wesentlichen Einfluss auf den Phänotyp und die Funktion der Monozyten. Zwei Stunden nach der ersten Alkoholeinnahme kommt es zu einem Anstieg der proinflammatorischen Monozyten im Blut. Dies ist gefolgt von deren Differenzierung zu antiinflammatorischen Monozyten weitere zwei und vier Stunden später. Ebenso ist die oberflächliche Expression von TLR4 anfänglich erhöht und wesentlich runterreguliert im Verlauf. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass Alkohol einen biphasischen Effekt auf die Immunantwort hat. Funktionell setzt Alkohol die Aktivierung des NLRP3-Inflammasoms und die Adhäsionsvermögen der Monozyten herab. Zusammenfassend induziert eine schwere Verletzung einen wesentlichen Anstieg von proinflammatorischen Monozyten im Blut der PatientInnen und deren intrazellulären Spiegel von ROS. Dies könnte einerseits die PatientInnen vor einer bakteriellen Infektion schützen, anderseits bei überschießender Immunantwort auch zu weiterreichender Gewebeschädigung beitragen. Zusätzlich könnte die Hyporesponsivität der Monozyten gegenüber einem zweiten Stimulus wie eine Operation oder Bakterienbelastung, dazu beitragen, dass schwerverletzte PatientInnen deutlich anfälliger für sekundäre inflammatorische Komplikationen sind. Da Monozyten eine TLR4-Toleranz und verminderte Aktivierung des NLRP3-Inflammasoms in der Folge von Alkoholintoxikation aufweisen, könnte Alkohol den immunsupprimierenden Effekt in schwerverletzten PatientInnen sogar verstärken. Nachdem wir das antiinflammatorische Potenzial von CC16 in früher unfallbedingten Sepsis bestätigten, könnte eine intrapulmonale Administration von CC16 relevant für die Entwicklung von neuartigen therapeutischen Maßnahmen bei Lungenverletzungen sein und sollte deswegen weiteruntersucht werden.

Although the development of advanced treatment algorithms of severely injured patients has significantly increased the posttraumatic survival rates, these patients are still highly susceptible for the development of secondary infections during their clinical stay. Traumatic injury induces an exaggerated pro-inflammatory immune response that depending on the intensity and imbalance to anti-inflammatory response may have further reaching deteriorating effects on patient’s health. Therefore, the analysis and the understanding of the ongoing humoral and cellular immunological changes in severely injured patients may prospectively represent a valuable therapeutic target. At cellular level, tissue-resident macrophages, monocytes, and neutrophils initiate an immediate immune response to clear the tissue damage and protect the host from invading pathogens. Trauma-induced immunosuppression with subsequent development of multi organ failure has been associated with aberrant functionality of monocytes. Although their phenotypic shift has been linked to several pathologies, data about the posttraumatic shift of monocyte population were missing. Therefore, in this thesis, the redistribution of classical CD16-CD14bright, intermediate CD16+CD14bright, and non-classical CD16+CD14low monocyte subsets and the function regarding their antimicrobial activity were evaluated within the first 12 hours posttrauma in severe injured patients. Moreover, finding a potential therapeutic target that counteract the ongoing secondary inflammatory complications, would significantly improve the posttraumatic treatment management. Pulmonary club cell protein 16 (CC16) has anti-inflammatory properties and its abnormal occurrence in the lungs and in the blood has been associated with several lung diseases. Therefore, we evaluated the impact of CC16 on systemic and local distribution of pro-inflammatory Ly6Cbright and anti-inflammatory Ly6Clow monocyte and macrophage subsets and its anti-inflammatory potential in murine model of early trauma-induced sepsis, consisting of blunt thoracic trauma and cecal ligation and puncture (CLP). Finally, up to 50% of patients admitted to emergency department are alcohol intoxicated, making them additionally susceptible for secondary infections. Acute alcohol intoxication transiently leads in monocytes to Toll-like receptor (TLR)4 tolerance towards endotoxin and subsequent downregulation of NLRP3 inflammasome activation and the secretion of pro-inflammatory cytokines such an interleukin-1β, but without considering the monocyte subsets. Therefore, we evaluated the impact of binge drinking on the distribution of monocyte subsets and their NLRP3 inflammasome activation in healthy subjects in time-dependent manner. The study has shown that severe traumatic injury induces phenotypic shift of monocytes toward the pro-inflammatory intermediate CD16+CD14bright subset. This is paralleled by significantly enhanced generation of reactive oxygen species (ROS) by all subsets. Ex vivo stimulation with phorbol 12-myristate 13-acetate significantly increased those, however, significantly less in intermediate CD16+CD14bright and non-classical CD16+CD14low subsets compared to healthy subjects, suggesting a hyporesponsiveness to secondary hit. In line, thoracic trauma with subsequent CLP increases the ratio of pro-inflammatory Ly6Cbright to anti-inflammatory Ly6Clow monocyte and macrophage subsets systemically and locally. Intrapulmonary neutralization of CC16 before CLP induction enhances the pro-inflammatory phenotypes, pulmonary damage, and the level of pro-inflammatory mediators tumor necrosis factor, monocyte chemoattractant protein-1, and receptor for glycation of end-products. Lastly, alcohol intoxication of 1‰ has significant impact on the monocyte subsets and their functions. Two hours after the first alcohol shot, monocytes differentiate towards the pro-inflammatory phenotype with a later shift toward the anti-inflammatory phenotype further two and four hours later. Similarly, the initial upregulation of TLR4 expression is followed by significant decline, suggesting biphasic effect of alcohol on immune response. Functionally, alcohol downregulates the NLRP3 inflammasome activation and the adhesive capacity of monocytes in time-dependent manner. Taking together, severe traumatic injury shifts the monocytes toward their pro-inflammatory subsets and enhances their generation of ROS. This may not only protect the patients from bacterial infections, but also contribute to deteriorated tissue damage in higher extent. On the other hand, the hyporesponsiveness of monocytes towards secondary hit such as surgery or bacterial load may contribute to the high susceptibility of severely injured patient for developing secondary complications. As shown by TLR4 tolerance and downregulation of NLRP3 inflammasome activation, an acute alcohol intoxication could even potentiate the immunosuppressing effects in severely injured patients. Since we confirmed the anti-inflammatory potential of CC16 in early trauma-induced sepsis, its local supplementation following traumatic injury may be highly relevant for the development of novel therapeutic intervention for patients with lung injuries and should be investigated in further studies.