Entwicklung eines Protein-Kopplungsverfahren basierend auf WW-Domänen

Abstract

WW-Domänen sind kleine, etwa 30-40 Aminosäuren umfassende Proteindomänen, deren Bezeichnung sich von zwei konservierten Tryptophanresten ableitet. Durch Bindung an prolinreiche Sequenzen vermitteln sie Protein-Protein-Wechselwirkungen im Kontext zahlreicher zellulärer Prozesse. In der vorliegenden Arbeit wird die Entwicklung eines Verfahrens zur Kopplung von rekombinanten Proteinen beschrieben, die durch genetische Fusion mit der ersten WW-Domäne (WW1) des humanen Formin-bindenden Proteins 11 (FBP11) bzw. einer prolinreichen Sequenz mit einem PPLPP-Motiv spezifisch aneinander assoziiert werden können. Anhand von Cystein-Varianten von WW-Domäne und Ligand wird eine kovalente Stabilisierung dieses Komplexes in Form einer intermolekularen Disulfidbrücke bewerkstelligt. Die Effizienz und allgemeine Anwendbarkeit des Verfahrens konnte anhand einer modellhaften Kopplung von rekombinanter Glutathion-S-Transferase (GST) und dem grün fluoreszierenden Protein (GFP) demonstriert werden. Außerdem wurde die NMR-Struktur von der isolierten Domäne FBP11-WW1 im ungebundenen Zustand und im Komplex mit dem von Formin abgeleiteten Peptid APPTPPPLPP bestimmt. In Kombination mit einer Reihe von Fluoreszenz- und SPOT-Bindungsstudien konnte damit die strukturelle Basis der PPLPP-Erkennung von WW-Domänen der Klasse II aufgeklärt werden.

WW domains are small protein modules named after two conserved tryptophan residues that mediate protein-protein interactions in a wide range of cellular processes by binding to prolinerich sequences. Here the development of a method is described to couple recombinant proteins in vitro which have been fused to the first WW domain of the human Formin Binding Protein 11 (FBP11-WW1) and a proline-rich sequence containing a PPLPP-motif, used as binding adapters. Thus the directed association of target proteins is mediated by the affinity of the fused modules. By the insertion of a cystein residue into FBP11-WW1 and the ligand the association was covalently stabilized by an intermolecular disulfide bridge. The efficiency of this generally applicable system was demonstrated by the model coupling of recombinant Glutathion-Stransferase (GST) and Green Fluorescent Protein (GFP). Additionally the solution structure of the isolated FBP11-WW1 domain was solved in the unbound state as well as in complex with the peptide APPTPPPLPP, a sequence derived from Formin. In combination with fluorescence and SPOT binding measurements the structural basis of PPLPP-recognition by class II WW domains could be elucidated.