Pax7 directs postnatal renewal and propagation of myogenic satellite cells but not their specification

Abstract

Das Ziel der Arbeit war die Untersuchung der Rolle des myogenen Transkriptionsfaktors Pax7 bei der Spezifizierung und Aufrechterhaltung von Muskelsatellitenzellen. Da Satellitenzellen größtenteils für das postnatale Wachstum und die Regenerierung von Skelettmuskeln der Säugetiere verantwortlich sind, war diese Arbeit ein Versuch, die Rolle von Pax7 bei diesen zwei wichtigen Prozessen der Entwicklung und Homöostase der Skelettmuskulatur zu verstehen. Ein weiteres Anliegen war die Bestimmung der Position von Pax7 in der komplizierten Signalkaskade, welche die Spezifizierung und Differenzierung der Muskulatur in Säugetieren reguliert. In der Arbeit wurde ein weites Spektrum biologischer Methoden angewendet: allgemeine molekularbiologische Methoden (zum Beispiel DNA- und RNA-Isolierung, Klonierung, Southern- und Northernanalyse, Real Time PCR), histochemische Techniken (Paraffin- und Kryotomschnitte, histochemische und immunhistochemische Färbung der Gewebeschnitte und Zellkulturen) Elektronenmikroskopie und Zellkulturtechniken. Die vorliegende Analyse von Satellitenzellen in homozygoten Pax7 Mäusen ergab, dass Pax7 für die Spezifizierung der Satellitenzelllinie nicht notwendig ist, da unter Verwendung fünf verschiedener Methoden (Elektronenmikroskopie, Pax7-LacZ-Färbung, CD34-Färbung, in vitro Kultivierung von Satellitenzellen aus isolierten Muskelfasern und Analyse von Satellitenzellklonen) eine große Anzahl von Satellitenzellen in juvenilen homozygoten Pax7 Mäusen gefunden wurde. Stattdessen fand sich eine kontinuierliche Verringerung der Anzahl der Satellitenzellen bei der postnataler Entwicklung von homozygoten Pax7 Mutanten, was stark darauf hindeutet, dass Pax7 eine Rolle bei der Erneuerung und Verbreitung der Satellitenzellen spielt. Außerdem fand sich eine Wesentlichen normale Muskulatur in erwachsenen Pax7 Tieren, welche nicht ohne Beitrag der teilungsaktiven Satellitenzellpopulation zum Wachstum unreifer Muskeln erklärt werden kann. Zudem zeigte sich keine signifikante Reduzierung der Anzahl und Größe der Myotuben in juvenilen und erwachsenen homozygoten Pax7 Mäusen, was darauf hindeutet, dass die verbliebene Zahl der Satellitenzellen ausreicht, um ein im Wesentlichen normales Muskelwachstum zu erlauben. Erwachsene Pax7 Mäuse besitzen noch ein gewisses Potential zur Skelettmuskelregenerierung, obwohl die Effizienz der Regeneration stark eingeschränkt ist. Die Muskelregeneration in Pax7 Mäusen geht einher mit der Vermehrung der verbliebenen Pax7-LacZ Satellitenzellen und resultiert in zahlreichen regenerierten Myotuben, obwohl eine unvollständige, defekte Regeneration deutlich ist und eine vollständige Reparatur nie erreicht wird. Es ist von großer Bedeutung, die Mechanismen und Abläufe zu verstehen, die die Muskelregeneration regulieren, um Therapien und klinische Methoden zu entwickeln, die zu einer verbesserten Behandlung von Muskelerkrankungen führen. In der vorliegenden Studie wurde die Funktion von Pax7 als bedeutender Regulator der Satellitenzellerneuerung und des Wachstums neu definiert. Dieses Wissen wird helfen, die Verfügbarkeit und den Ersatz von Muskelstammzellen für therapeutische Zwecke, besonders im alten und kranken Muskel zu verbessern.

Pax7 is a paired box transcription factor expressed during embryonic and postnatal muscle development and regeneration. In the present work I have investigated of the role of this myogenic transcription factor in the specification and maintenance of muscle satellite cells. Since postnatal growth and regeneration of mammalian skeletal muscles are largely attributed to muscle satellite cells, I wanted to uncover the role of Pax7 in these processes and to gain more insights in the function of Pax7 in complicated signalling network governing specification and differentiation of muscle cells in mammals. A wide range of modern biological methods were used in the present work: general molecular biological techniques (for example DNA and RNA isolation, molecular cloning, Southern and northern nucleic acids analysis, Real Time PCR), histochemical techniques (paraffin and cryotome tissue sectioning, histochemical and immunohistochemical staining of tissue sections and cell cultures), electron microscopy and mammalian cell culture techniques. The present analysis of satellite cells in Pax7(-/-) mice has unambiguously established that Pax7 is dispensable for the specification of the satellite cell lineage since we detected a large number of satellite cells in juvenile Pax7(-/-) mutant mice using five different methods (electron microscopy, Pax7-lacZ staining, CD34 staining, in vitro cultivation of satellite cells from isolated myofibers and clonal satellite cell analysis). Instead, we detected a continuous decrease of the number of satellite cells in Pax7(-/-) mutants, which strongly suggests a role of Pax7 in the renewal and propagation of satellite cells. In addition, we found an essentially normal degree of muscle formation in adult Pax7 mutant animals that cannot be explained without the contribution of the highly proliferative satellite cell population to the growth of immature muscles. Neither juvenile nor adult Pax7 (-/-) mice displayed a significant reduction of the number and size of myotubes indicating that the remaining number of satellite cells sufficed to allow normal postnatal muscle growth. Moreover, adult Pax7(-/-) mice still own a certain potential for skeletal muscle regeneration although the efficiency of regeneration is severely hampered. The compromised regenerative response of Pax7(-/-) mice came along with an expansion of the remaining Pax7-lacZ satellite cells and resulted in numerous regenerated muscle fibers although faulty regeneration was evident and a complete repair was never achieved. It is of major importance to understand the mechanisms and pathways that govern muscle repair processes to develop applied therapeutic and clinical tools that will ultimately lead to an improved treatment of muscle disorders. In the current study was the function of Pax7 as a major regulator of satellite cell renewal and propagation was re-defined. This knowledge will probably help us to manipulate the availability of muscle stem cells for therapeutic purposes in particular in aged and diseased skeletal muscles.