In situ Hybridisierung an Hanf (Cannabis sativa L.) Chromosomen

Abstract

In der vorliegenden Arbeit sollten molekular- und cytogenetische Methoden genutzt werden, um Informationen über Struktur und Organisation geschlechtsgekoppelter DNA-Bereiche des Hanfes zu erlangen. Die Technik der Fluoreszens in situ Hybridisierung (FISH) sollte genutzt werden, um die Geschlechtschromosomen mit spezifischen Sonden zu markieren. Dazu wurden verschiedene Strategien zum Auffinden und Isolieren von geschlechtsgekoppelten DNA-Fragmenten entwickelt und angewendet. PCR-basierende Methoden wurden erfolgreich genutzt, um männlich-spezifische sowie PAR-spezifische SCAR-Marker zu entwickeln. Die DNA-Fragmente dieser Marker wurden als Sonden für die FISH genutzt. Die Methode des PCR-Walkings konnte erfolgreich angewendet werden, um die Detektierbarkeit kurzer Sonden durch Vergrößerung ihrer DNA-Fragmente zu verbessern. Weiterhin konnte die Methode der Fluoreszens in situ Hybridisierung von Hanfchromosomen erfolgreich etabliert werden. Erstmals konnte damit die Lokalisierung der 5S- und 25S-rDNA Bereiche auf den Chromosomen des Hanfes festgestellt werden. Damit gelang es, zwei der zehn Chromosomenpaare des Hanfes eindeutig zu markieren. Die meisten aus geschlechtsspezifischen PCR-Markern entwickelten Sonden zeigten bei der FISH unspezifische repetitive Signale. Aber mit der von dem Marker OPC-112700 abstammende Sonde C11Seq konnten bei der FISH von Chromosomenpräparaten einer Hanfherkunft je ein Signal auf zwei Chromosomen erzeugt werden. Aufgrund der unterschiedlichen Größe der beiden Chromosomen kann angenommen werden, dass es sich dabei um das Geschlechtschromosomenpaar des Hanfes handelt.

In the presented work information about structure and organisation of sex linked DNA regions of hemp should be obtained with help of molecular and cytogenetic methods. With specific probes the sex-chromosomes of hemp should be marked. Therefore different approaches to discover and isolate sex linked DNA fragments were developed and applied. Most successful was the transformation of male and PAR specific RAPD and AFLP markers respectively. Using PCR techniques male specific and PAR specific SCAR markers were developed. To improve the detectability of small marker fragments when used as probe for in situ hybridization, increasing of the fragment´s length by amplifying the flanking regions left and right of the fragment was necessary. PCR walking was used successfully to amplify the fragment´s flanking regions. In situ hybridization of chromosome specimens could be adapted to hemp successfully. The sites for 5S- and 25S-rDNA genes could be located for the first time. Thus two of the ten chromosome pairs of hemp could be marked. Signals of most probes developed from the sex specific PCR markers were repetitively localized on the heterochromatic regions of all chromosomes. The probe C11Seq originating from the RAPD marker OPC-112700 showed a clear signal on two chromosomes when hybridized to chromosomes of a hemp accession. Due to the different size of both chromosomes it was assumed, that this signal was located on the sex chromosomes.