Rekonstitution und funktionelle Analyse des 3‘-Prä-mRNA-Prozessierungskomplexes

Abstract

Die 3‘-Prä-mRNA-Prozessierung fast aller eukaryotischen mRNAs ist eine zweistufige Reaktion: zuerst die endonukleolytische Spaltung, gefolgt von der Addition eines Poly(A)-Schwanzes. Während die Komponenten für den zweiten Schritt bekannt sind, waren sie für eine Rekonstitution der 3‘-Spaltung unvollständig. So ist nebst den bekannten Faktoren CFII, CstF, mPSF, mCF und PAP, auch das Protein RBBP6 essenziell. CFI hingegen hat nur eine stimulierende Funktion. Insgesamt sind somit 14 Polypeptide für die 3‘-Spaltung essenziell. Zudem ist die Reaktion ATP-Abhängig. Nicht aber die Hydrolyse, sondern die Bindung an die Clp1-Untereinheit von CFII mit submikromolarer Affinität unterstützt die RNA-Spaltung. Auch zeigten nur zwei der drei kanonischen Poly(A)-Polymerasen, PAP-ɑ und PAP-ɣ, eine Aktivität in der 3‘-Prozessierung. PAP-β und die nicht-kanonische PAP ‚TUT1‘ zeigten in Übereinstimmung mit ihren beschriebenen biologischen Rollen keine Funktion in der rekonstituierten 3‘-Spaltung.

The 3′ pre-mRNA processing of almost all eukaryotic mRNAs is a two-step reaction: first endonucleolytic cleavage, followed by the addition of a poly(A) tail. While the components for the second step are known, they were incomplete for reconstitution of the 3' cleavage. In addition to the well-known factors CFII, CstF, mPSF, mCF and PAP, the protein RBBP6 is also essential. CFI, on the other hand, only has a stimulating function. A total of 14 polypeptides are therefore essential for 3' cleavage. In addition, the reaction is ATP dependent. However, it is not hydrolyzed, but rather binding to the Clp1 subunit of CFII with submicromolar affinity supports RNA cleavage. Also, only two of the three canonical poly(A) polymerases, PAP-ɑ and PAP-ɣ, showed activity in 3′ processing. PAP-β and the non-canonical PAP 'TUT1' showed no function in the reconstituted 3' cleavage, consistent with their described biological roles.