Untersuchung zur Erzeugung, Herstellung und partiellen Charakterisierung thermoresistenter mikrobieller Transglutaminase Varianten

Abstract

Mikrobielle Transglutaminasen (mTG) finden in der Lebensmittelindustrie breite Anwendung durch ihre Fähigkeit Proteine mittels Isopeptidbindung kovalent zu verknüpfen. In der vorliegenden Arbeit wurde eine thermisch resistente Variante der mTG, die TG16, mit einer Halbwertszeit bei 60°C von 38 min und einem TM von 66°C erzeugt. Interessanterweise, zeigen inaktivierte Varianten der TG16 eine Verschiebung des TM auf 69-70°C. Aggregationsstudien zeigen erstmals eine thermisch induzierte intramolekulare Quervernetzung des Enzyms vornehmlich an Position Q328. Ein verringerter KM -Wert (3,5 mM) der TG16 zum Wildtyp (8,6 mM) erklärt die erhöhte spezifische Aktivität für das Substrat CBZ-Gln-Gly. Bei einer Fermentation im 13,5 L Maßstab konnten volumetrischen Aktivitäten von 151700 U/L und biomassespezifische Aktivitäten von 5000 U/g BTM erreicht werden. Eine chromatographiefreie Reinigung der TG16 konnte etabliert werden, mit einer Ausbeute von 63 % bzw. 83 % der pro- TG16 respektive TG16.

Microbial transglutaminases (mTG) are widely used in the food industry due to their ability to covalently link proteins by means of isopeptide bond formation. In the present work, a thermally resistant variant of mTG, named TG16, with a half-life at 60°C of 38 min and a TM of 66°C was generated. Interestingly, inactivated variants of TG16 showed a shift of the TM to 69-70°C. Aggregation studies showed for the first time a thermally induced intramolecular cross-linking of the enzyme mainly at position Q328. A reduced KM value (3.5 mM) for TG16 compared to the wild type (8.6 mM) explains the increased specific activity for the substrate CBZ-Gln-Gly. In a 13.5 L-scale fermentation, volumetric activities of 151700 U/L and biomass-specific activities of 5000 U/g BDM were achieved. A chromatography-free purification of TG16 could be established, with a yield of 68 % and 83 % of pro-TG16 and TG16, respectively.