Synthese und Untersuchung von peptidischen Substraten der Histondeacetylasen

Abstract

Histondeacetylasen (HDACs) sind in ihrer biologischen Funktion als epigenetische Regulartoren in viele pathophysiologische Prozesse, wie zum Beispiel Stoffwechselstörungen, Krebs oder neurodegenerative Krankheiten, involviert. HDACs sind daher ein interessantes Target für die Wirkstoffentwicklung. Für die weitere Entwicklung von Effektoren der HDAC-Aktivität ist es notwendig, stabile und zuverlässige Messverfahren mit hohem Probendurchsatz zu entwickeln. In dieser Arbeit wurden direkte und kontinuierliche Messverfahren entwickelt, um die HDAC-Aktivität über die Änderung der Fluoreszenzintensität und die UV-Absorption zu detektieren. Vor allem für SIRT2, SIRT3 und HDAC11 konnten neue und deutlich verbesserte Substrate entwickelt werden, für welche SIRT2 extrem niedrige KM-Werte aufweist (1 nM) und katalytische Effizienzen von bis zu 15 000 000 M-1s-1. Für SIRT2 und SIRT3 konnte ein direkter und kontinuierlicher fluoreszenzbasierter Assay entwickelt werden, der die Messung mit nativem Myristoylrest ermöglicht, um hochaktive Demyistoylase-Inhibitoren zu identifizieren. Ebenso wurde die Acylspezifität von HDACs für kurze Acylreste (Pyruvoyl-, Lactoyl-, Glyoxalylreste), die erst kürzlich als neue Lysinmodifikation in vivo nachgewiesen wurden, untersucht.

In their biological function as epigenetic regulators, histone deacetylases (HDACs) are involved in many pathophysiological processes, such as metabolic disorders, cancer or neurodegenerative diseases. Therefore, HDACs are an interesting target for drug development. For the further development of effectors of the HDAC activity, it is necessary to develop robust and reliable assays with high sample throughput. In this work, direct and continuous assays were developed to monitor the HDAC activity via the change in fluorescence intensity and UV absorption. Especially for SIRT2, SIRT3 and HDAC11 new and significantly improved substrates could be developed, for which SIRT2 shows extremely low KM values (1 nM) and catalytic efficiencies of up to 15 000 000 M-1s-1. For SIRT2 and SIRT3 a direct and continuous fluorescence-based assay was developed which allows the measurement with native myristoyl residue to identify highly active demyristoylase inhibitors. The acyl specificity of HDACs for short acyl residues (pyruvoyl, lactoyl, glyoxalyl residues), which were recently identified as a new lysine modification in vivo, was also examined.