About the impact of altered RAS-MAPK and PI3K-AKT signalling in human developmental disorders

Abstract

Der RAS/MAPK und der PI3K/AKT/mTOR Signalweg stellen komplexe und miteinander vernetzte zelluläre Signalwege dar, die viele biologische Prozesse regulieren. Mutationen, welche die Regulierung dieser Signalwege stören, sind verantwortlich für verschiedene Erkrankungen, die von Tumoren, entstanden durch erworbene somatische Mutationen, bis hin zu einem breiten Spektrum von seltenen Entwicklungsstörungen mit angeborenen Veränderungen reichen. RASopathien ist der Überbegriff für eine Gruppe von Erkrankungen, welche durch Mutationen in Genen, die für Komponenten oder Modulatoren des RAS/MAPK Signalweges kodieren, hervorgerufen werden. Betroffene Personen zeigen ein typisches Muster an physischen Anomalien sowie kognitive Defizite unterschiedlichen Ausmaßes. Ferner sind Mutationen in Komponenten des PI3K/AKT/mTOR Signalweges insbesondere mit angeborenen Erkrankungen assoziiert, bei welchen Wachstum von betroffenen Körperregionen oder Organen, sowie die Entwicklung des Gehirns beeinträchtigt sein können Die massive Parallelsequenzierung (auch bekannt unter dem Begriff „Next Generation Sequencing“, NGS) wurde in den vergangenen zehn Jahren rapide weiterentwickelt und bietet neue Möglichkeiten für die Identifikation von genetischen Veränderungen, die Krankheiten verursachen können. Der hohe Durchsatz und die Sequenziertiefe dieser neuen Methoden machen die Untersuchung mehrerer Gene (bis hin zu Exomen und Genomen) in einem Experiment sowie die Detektion von sehr geringgradigen Mosaiken (wie in Tumoren) möglich. Das Ziel dieser Arbeit war es, die Auswirkungen von genetischen Veränderungen, die zur Dysregulation von RAS/MAPK und PI3K/AKT/mTOR Signalwegen führen und menschliche Entwicklungsstörungen verursachen können, mit Hilfe neuer NGS Technologien weiter zu untersuchen. Ein gemeinsames Merkmal der RASopathien ist die Beeinträchtigung der kognitiven Fähigkeiten. Unter anderem ist der RAS/MAPK Signalweg in neuronalen Zellen in die Regulation synaptischer Plastizität involviert. Ein Ziel dieser Arbeit war es, die Bedeutung genetischer Veränderungen, die direkt oder indirekt das Signalnetzwerk des RAS/MAPK Signalwegs betreffen, bei Patienten mit Intelligenzminderung (ID) zu untersuchen, welche nicht die äußerlich erkennbaren Merkmale der RASopathien zeigten. Zur Identifikation direkter und indirekter Interaktionspartner von Molekülen aus dem RAS/MAPK Signalweg wurde in silico ein Interaktionsnetzwerk um die RAS Moleküle konstruiert, anhand festgelegter Kriterien weiter differenziert, und somit eine Liste von 329 Kandidatengenen erstellt. In diesem Teilprojekt wurden mittels gezielter Re-Sequenzierung des ausgewählten Multigen-Panels eine Kohorte von 166 Patienten mit ungeklärter oder unspezifischer ID sowie eine Kontrollgruppe von 120 Patienten ohne ID per NGS untersucht. Die so gefundenen Sequenzvarianten wurden anhand ihrer Art, ihres Vorkommens in Datenbanken und der in silico-Prädiktion ihrer Auswirkungen auf das entstehende Genprodukt gefiltert. VII Durchschnittlich wurden vier sehr seltene oder unbekannte Varianten pro Individuum (0-12 Varianten) in dem untersuchten Multigen-Panel gefunden. Die besten Kandidaten wurden mit konventioneller Sanger-Sequenzierung bestätigt und die Segregation in den Familien überprüft. In zwei der 166 Studienpatienten wurden wahrscheinlich krankheitsverursachende Veränderungen in Genen gefunden, welche nun als kausale Gene für ID etabliert sind. Die Ergebnisse zeigen, dass bei einem so heterogenen Krankheitsbild wie unspezifische/nicht-syndromale ID monogene Defekte mit Bezug auf den RAS/MAPK Signalweg einen kleinen aber durchaus relevanten Teil ausmachen. Darüber hinaus wurden in 47 weiteren Fällen potenziell pathogene Varianten in bereits etablierten Genen für ID sowie in neuen Genen mit Bezug auf den RAS/MAPK Signalweg gefunden, deren Pathogenität aber nicht definitiv bewiesen werden konnte. Um diese Ergebnisse zu verifizieren und ist eine Bestätigung in größeren Kohorten erforderlich. Im zweiten Teilprojekt lag der Fokus auf einer Krankheitsgruppe, die durch somatische Mutationen in Genen des RAS/MAPK und des funktionell verbundenen PI3K/AKT/mTOR Signalwegs verursacht werden. In dieser Studie wurden spezifische KRAS Mutationen im Mosaik als krankheitsverursachende Veränderungen beim okuloektodermalen Syndrom (OES) und bei der enzephalo-kranio-kutanen Lipomatose (ECCL) gefunden. Dieser Zusammenhang bestätigte die kurz zuvor anhand von zwei Fällen postulierte Zugehörigkeit der Krankheitsgruppe zu den sogenannten “Mosaik-RASopathien”. Bei Patienten mit phänotypischen Merkmalen des „congenital lipomatous overgrowth, vascular malformations, and epidermal nevi“ (CLOVES) wurden PIK3CA-Hotspot-Mutationen in DNA aus verschiedenen Geweben untersucht. Mittels Sanger-Sequenzierung waren die Detektionsrate und die Quantifizierung der mutierten Allele auf minimal 10-15% begrenzt. Deswegen wurden zusätzlich Fragment-Analysen und NGS verwendet, mit welchen die Sensitivität auf einen Mosaikanteil von minimal <1-3% gesteigert werden konnte. Mittels NGS lag die Detektionsrate mutierter Allele sogar in Blutproben bei 1% oder darunter. Unsere Daten bestätigen, dass Material aus dem betroffenen Gewebe für die Detektion der zugrunde liegenden Mutation in PROS (PIK3CA-related overgrowth spectrum) notwendig ist, während Blutproben in den meisten Fällen eine ungeeignete Quelle darstellen. Verbesserte Detektionsmethoden werden ebenfalls für andere Gewebe mit niedriggradigem Mosaikanteil benötigt. Zusammenfassend liefert diese Studie einen zusätzlichen Beitrag zum Verständnis der Bedeutuung von Mutationen in den RAS/MAPK und PI3K/AKT/mTOR Signalwegen bei Störungen der körperlichen und geistigen Entwicklung des Menschen. Sie belegt den Nutzen NGS-basierter Verfahren bei der Hochdurchsatz-Sequenzierung mehrerer Gene in größeren Patientenkohorten und bei der sensitiven Detektion von Mosaiken in DNA aus verschiedenen Geweben mittels sehr tiefer Sequenzierung.

The RAS/MAPK and PI3K/AKT/mTOR pathways represent complex interconnected cellular signalling pathways that regulate many biological processes. Mutations leading to disturbance of these signalling pathways have been shown to be involved in various human diseases, ranging from tumors with acquired somatic mutations to a broad spectrum of rare developmental disorders with congenital alterations. RASopathies is the new umbrella term for a disease group caused by mutations in genes encoding various components and modulators of the RAS/MAPK signalling pathway leading to dysregulation of signal flow. Affected individuals display a common pattern of physical anomalies along with cognitive deficits of variable severity. Mutations in components of the PI3K/AKT/mTOR pathway, on the other hand, are particularly associated with congenital disorders showing altered growth of body parts or organs, again including the brain and affecting its function. During the last 10 years the technology of massive parallel sequencing (also known as next-generation sequencing, NGS) has rapidly evolved and provided new opportunities for identification of genetic alterations underlying human disorders. This thesis aimed at further investigating the impact of genetic changes leading to altered RAS/MAPK and PI3K/AKT/mTOR signalling in human developmental disorders with the help of novel NGS technologies. Considering the impairment of cognitive functions as a common feature of RASopathies and the known importance of the RAS/MAPK signalling pathway is the regulation of synaptic plasticity, the aim of one subproject of this thesis was to further investigate the importance of genetic alterations directly or indirectly affecting the signalling network around RAS/MAPK for intellectual disability (ID) in humans, outside the syndromic context of RASopathies. For this purpose, an interaction network around the RAS molecules was constructed in silico and further prioritized according to various criteria, generating a list of 329 candidate genes for the investigations in humans. In the current project, a targeted resequencing approach was used and examined by means of NGS in a cohort of 166 patients with unexplained / unspecific ID as well as a control group of 120 subjects without ID. Thus identified sequence variants were filtered by occurrence in databases and the silico predicted effects on the gene product. On average, in the examined RAS pathway genes, ~4 very rare or unknown variants were identified per individual (Range: 0-12). The best candidates were validated by conventional sequencing and segregation studies in the family. In the 166 study patients, the most likely causative genetic change was found in two individuals in genes, which are now established as ID genes. The results show that even in a disease as heterogeneous as ID, monogenic defects of molecules with respect to the RAS signalling pathway make a small but relevant part. In order to identify further mutations, targeted examinations in larger cohorts are to be carried out for the best new candidate genes and/or co-operation with other groups that have operated exome sequencing in ID cohorts. A second subproject was focused on a group of diseases caused by somatic mosaic mutations in genes of the RAS signalling pathway and the functionally linked PI3K/AKT/mTOR signalling pathway. The current study identified specific KRAS mutations as the cause of the oculoectodermal syndrome (OES) and the encephalo-cranio-cutaneous lipomatosis (ECCL), thus confirming the association of these related diseases to the group of "mosaic RASopathies". In patients presenting with PIK3CA-related overgrowth spectrum (PROS), hot spot mutations of PIK3CA were identified by studying DNA from various tissues. By Sanger sequencing, the detection levels and quantification of mutant alleles were limited to 10-15%. So, fragment analysis and NGS methods were further applied which increased the mutant allele detection to <1-3%. With NGS method, mutant allele ratios for blood samples could also be detected and was 1% or less. Our data confirm that material from affected tissue is essential for detecting the underlying mutation in PROS whereas blood DNA would be a secondary source in most cases. Improved detection methods may also be required for other tissues with low level somatic mosaicism.