Characterization of the immunproteasome subunits LMP2 and LMP7 in the mouse brain

Abstract

Die hier verfasste Dissertation beinhaltet eine Lokalisationsstudie sowie eine funktionelle Charakterisierung der katalytischen Untereinheiten LMP2 und LMP7 des Immunoproteasomes (IPs) im Gehirn der Maus. Das IP ist eine spezifische Form des Proteasoms, welches konstitutiv in Zellen des Immunsystems exprimiert wird und auf Grund seiner speziellen proteolytischen Eigenschaften eine wichtige Rolle für die Prozessierung der MHCI Antigene spielt. Interessanterweise können entzündungsfördernde Zytokine auch zu einer Induktion von IPs im Gehirn führen. Dabei wurde die Existenz des IP vor allem mit neurodegenerativen Erkrankungen in Verbindung gebracht. Die genaue zelluläre Expression sowie mögliche Funktionen sind in diesem Zusammenhang jedoch noch weitestgehend unerforscht. Anhand von immunohistologischen Verfahren und konfokaler Mikroskopie konnte die Expression der IP Untereinheiten LMP2 und LMP7 hauptsächlich in Iba1-positiven Mikroglia nach zerebraler Ischämie gezeigt werden. Des Weiteren konnte mit biochemischen Methoden ein anhaltender, massiver Anstieg LMP2- und LMP7- Proteingehalts in einer Zeitspanne von bis zu 4 Tagen nach Ischämie detektiert werden. Die Expression konstitutiver Proteasomuntereinheiten als auch ubiquitinierter Proteine scheinen dabei unverändert und implizieren eine spezialisierte Funktion des IPs neben dem physiologischen Proteinabbau in diesem Zusammenhang. Außerdem konnte mit Hilfe eines LMP7-defizienten Mausmodells im Vergleich zu Wildtyp-Kontrollen gezeigt werden, dass die Expression von LMP7 anscheinend neuroprotektive Eigenschaften besitzt und das Ausmaß der neuralen Gewebeschäden sowie der sensomotorischen Störungen nach zerebraler Ischämie limitiert. Darüber hinaus scheint LMP7 eine wichtige Rolle für die Aktivierung und morphologische Ausprägung der Mikroglia Zellen zu besitzen. Ein Mangel an LMP7 führt zwar zu einem Anstieg an Mikroglia innerhalb der Infarktregion, aber auch zu einer signifikanten Reduktion an peripheren infiltrierenden Immunzellen einschließlich Monozyten, Dendritische Zellen und Makrophagen. Auf Grund dessen und der vermehrten Detektion von Aktivitätsmarkern in LMP7-defizienten Mikroglia können ein vermindertes phagozytisches Leistungsvermögen sowie veränderte inflammatorische Prozesse nach Ischämie angenommen werden. Diese Hypothese spiegelt sich zudem in einer tendenziell veränderten Zytokininduktion in LMP7-defizienten Mikroglia wieder. Zusammenfassend zeigen diese Ergebnisse eine relevante Bedeutung des IPs für die zelluläre Funktionalität von Mikroglia Zellen im Allgemeinen und unter ischämischen Bedingungen im Besonderen sowie möglicherweise anderer neuraler Pathologien. Neben einem grundlegenden wissenschaftliches Ergenntnisgewinn hinsichtlich der Präsenz, Induktion und funktionellen Rolle von IPs im Säugetiergehirn, deuten diese Daten auch auf eine potentielle klinische Relevanz hin. Die gezielte therapeutische Aktivierung und/oder Inhibition des IP in bestimmten Bereichen des geschädigten und/oder bedrohten Hirngewebes nach zerebraler Ischämie könnte zu einer vorteilhaften Modulation der Mikrogliaaktivität genutzt werden und den Verlauf von zerebralen Pathophysiologien im Zusammenhang mit neuroinflammatorischen und neurodegenerativen Prozessen positiv beeinflussen.

This dissertation comprises a localization analysis as well as a functional characterization of the hitherto barely assessed, specific immunoproteasome (IP) subunits LMP2 and LMP7 in the mouse brain. The IP is a specialized proteasome subtype, which is constitutively expressed in immune cells and plays an important role for the MHCI antigen processing due to its proteolytic activities. Interestingly, IP formation can be induced by pro-inflammatory cytokines also in non-immune tissue including the brain. Notably, the presence of IPs is mainly associated with neurodegenerative diseases or pathologies, even though the functional repertoire of IP subunits in this context remains largely unidentified. Using immunohistological methods and confocal microscopy, Iba1-positive microglia cells were determined as the predominant cell type expressing the IP subunits LMP2 and LMP7 under normal and ischemic conditions in the mouse brain. Further, a massive increase in gene expression of LMP2 and LMP7 over a period of 4 days after ischemia was confirmed by biochemical approaches. Interestingly, protein levels of the constitutive standard proteasome subunits and levels of ubiquitinated proteins were not altered and imply a specialized function of the IP beside the physiological proteolysis within this context. Moreover, LMP7 seems to exert a neuroprotective effect during cerebral ischemia. Notably, in an LMP7-deficient mouse model, the extent of neural damage and sensorimotor deficits was increased compared to wild type littermates after cerebral ischemia. In addition, LMP7 seems to play an important role for the activation and morphological phenotype of microglia cells. Moreover, LMP7 deficiency leads to an increased numerical density of microglia within the infarct area, but more importantly to a significant reduction of infiltrating peripheral immune cells including monocytes, dendritic cells and macrophages. Furthermore, expression of microglial activation markers were enhanced, and cytokine induction seemed altered in LMP7-deficient mice. These results indicate a potentially reduced phagocytic capability as well as altered inflammatory processes after ischemia in these mice. In conclusion, these data point towards a functional relevance of microglial IP expression under ischemic conditions and potentially also under other neuropathological cicumstances. This work does not only contribute to a deeper understanding of the presence, induction and functional repertoire of IPs in the mammalian brain, but also provides evidence for a possible clinical and translational value of the obtained data in the context of neuroprotection. The specific clinical targeting of the IP activity and the subsequent modulation of microglia activity within certain vulnerable brain regions could introduce beneficial therapeutic strategies after cerebral ischemia and other brain injuries accompanied by neuroinflammatory and neurodegenerative processes.