Ageing in a dish : strategies ro rejuvenate neuronal cell cultures and balance protein homoeostasis

Abstract

Ageing is a central aspect of life itself. Even after extensive research during the last decades, little is known about this highly complex biological process. In conclusion, the achievement of scientific milestones such as an increased healthspan or the retaining of cognitive functions is still in distant future. Another aspect poorly understood in terms of biochemical signalling pathways is the communication via mechanical cues also termed mechanosensing and -transduction. Both aspects, neuronal ageing and mechanosensing in neuronal cells will be addressed and connected in this thesis. As central aspect, first we present an in vitro model optimised for long-term culturing conditions to define hallmarks of neuronal ageing in more detail. Known as one central hallmark of ageing from mammalian and human research, the focus of investigations was set on the control of proteostasis. With different experimental approaches such as immunocytochemistry, western blotting, FUNCAT and BONCAT, we showed that protein translation and -degradation is indeed decreased in aged neuronal cells, ultimately leading to the formation of protein aggregates. These protein aggregates formed in aged neurons were successfully resolved by applying the polyamine Spermidine. The ability of Spermidine to restore translational capacities to juvenile levels was functionally linked to activation of the translational regulator elF5A. In the next part, we introduced a new hallmark of the neuronal ageing process: the sensation of mechanical signals and the integration of mechanical cues into biochemical pathways. This thesis underlines that polyacrylamide gels with defined stiffness are a suitable cell culture system to investigate the impact of mechanical cues on neuronal morphology and protein translation. We stated that soft substrates, presenting a stiffness comparable to juvenile brain tissue, promote dendritic complexity and synapse maturation during early development. Further, protein synthesis and spontaneous Ca2+ transients were enhanced on soft substrates most likely connected to activation of the mechanosensor Piezo- 1. A proteome analysis provides a detailed list of proteins regulated by substrate stiffness during early development mainly from the family of cytoskeleton regulators. This list of differently regulated proteins is a promising starting point for future investigations. Finally, we proved that stiffness regulated substrates are suited also for the growth of long-term neuronal cultures and that soft environment prevented the formation of protein aggregates in aged neurons in vitro.

Leben bedeutet auch Altern. Und trotz intensiver Forschung in den letzten Jahrzehnten bleiben viele Aspekte dieses komplexen biologischen Prozesses weiterhin unaufgeklärt. Erstrebenswerte wissenschaftliche Errungenschaften, wie die Verlängerung der Anzahl gesunder Lebensjahre oder die Aufrechterhaltung kognitiver Leistungen, basierend auf der biochemischen Forschung, sind bisher ausgeblieben. Ein weiterer Bereich, der in Bezug auf biochemische Signalwege wenig erforscht ist, ist die Fähigkeit von Zellen durch mechanische Reize zu kommunizieren, auch "mechanosensing" oder "mechanotransduction" genannt. Beide Aspekte, das Altern von neuronalen Zellen und die Kommunikation mittels mechanischer Reize, werden in dieser Arbeit untersucht und thematisch verbunden. Als zentraler Ausgangspunkt wurde ein für das Überleben von Langzeit-Zellkulturen optimiertes Zellkultursystem entwickelt, um Merkmale von neuronalem Altern umfangreich zu beschreiben. Wissenschaftliche Arbeiten in diversen Modellorganismen haben gezeigt, dass ein entscheidendes Kennzeichen des Alterungsprozesses die fehlgeschlagene Kontrolle von Proteindynamiken ist. Mit verschiedenen experimentellen Herangehensweisen wie Immunfärbungen, Western Blot, FUNCAT und BONCAT wurde in dieser Arbeit gezeigt, das Proteinsynthese und Proteinabbau tatsächlich in gealterten neuronalen Zellen verlangsamt sind, was letzendlich zur Bildung von Proteinaggregaten beiträgt. Diese Proteinaggregate konnten erfolgreich durch die Applikation des Polyamines Spermindine aufgelöst werden. Die Fähigkeit von Spermidine Proteintranslation "zu verjüngen" wurde funktionell mit der Aktivierung des Translationsregulators eIF5A in Verbindung gebracht. Im nächsten Abschnitt dieser Arbeit wird ein neues Kennzeichen von neuronalem Altern vorgestellt: das Wahrnehmen von mechanischen Reizen und die Integration dieser in biochemische Signalwege. Wir bestätigen, dass Polyacrylamide Gele, die eine definierte Steifheit im Zellkultursystem präsentieren, geeigent sind, um den Einfluss von mechanischen Reizen auf Zellmorphologie und Proteintranslation zu untersuchen. Es wurde gezeigt, dass weichere Substrate mit einer Beschaffenheit vergleichbar mit jungem Hirngewebe, die Ausbildung von Dendriten und Synapsenreifung begünstigen. Weiterhin wurde beschrieben, dass spontane Ca2+ Signale und Proteinsynthese erhöht sind, wenn Zellen auf weichen Substraten wuchsen, was vermutlichen im Zusammenhang mit der Aktivierung des Mechanosensors Piezo-1 steht. Eine Proteomeanalyse stellte eine detailierte Zusammenstellung an Proteinen bereit, die durch den Einfluss von mechanischen Reizen in ihrer Expression reguliert werden. Ein Grossteil dieser Proteine stammt aus der Familie der Zytoskelett-Regulatoren und bildet einen vielversprechenden Ausgangspunkt für weitere Experimente. Abschliessend wurde gezeigt, dass Polyacrylamide Gele mit definierter Steifheit auch für Langzeit-Zellkulturen geeignet sind und dass auf weicherem Untergrund weniger Proteinaggregate in alternden Neuronen gebildet werden.