Untersuchung von Proteinbindung an Liposomen mittels Fluoreszenzmikroskopie und dcFCCS

Abstract

COPII-Vesikel vermitteln den Transport von Membranproteinen zwischen dem ER und Golgi. Der COPII-Proteinkomplex besteht aus den Proteinen Sar1, Sec23/Sec24 und Sec13/Sec31. Bisher ist die Rolle der Hydrolyse des GTP durch Sar1 bei der Abschnürung der Transportvesikel unklar. Zu quantitativen Bindungsparametern des Sar1 wurden kaum Untersuchungen durchgeführt. Die Arbeit zeigt mit Hilfe der konfokalen Laser-Scanning-Mikroskopie, dass ohne die Hydrolyse des GTP durch das Sar1p keine Abschnürung kleiner Vesikel aus GUV stattfinden konnte. Stattdessen zeigten sich lange tubuläre Strukturen. Dabei war es nicht entscheidend, wodurch die Hydrolyse unterbunden wurde. Mit Hilfe des dcFCCS wurden Bindungstests durchgeführt, und eine Dissoziationskonstante für Sar1p an kleinen Vesikeln in Anwesenheit von GMP-PNP ermittelt. Diese beträgt kD= (2,1 ± 1,1) µM. Die dcFCCS ist gut für Bindungsmessungen von Proteinen an Vesikel geeignet. Mögliche probenbedingte Störgrößen können berücksichtigt werden.

COPII vesicles promote transport of membrane protein between ER and Golgi. The COPII-protein complex consists of the proteins Sar1, Sec23/Sec24 and Sec13/Sec31. Up to now, the role of GTP-hydrolysis of the GTP by Sar1 within the process of fission remains unclear. There are no investigations to quantify the binding parameter of Sar1. This work shows by using confocal laser-scanning-microscopy there is no fission of small vesicles out of GUV without the hydrolysis of Sar1. But long tubular structures occur instead. For this it doesn’t matter in which way the hydrolysis was blocked. Binding assays were carried out by using dcFCCS. The dissociation constant for Sar1 to small vesicles was determined in the presence of GMP-PNP, kD= (2,1± 1,1) µM. DcFCCS is a good method for measuring binding of proteins to vesicles. Disturbances can be considered.