Struktur und Dynamik der neuromuskulären Synapse von Drosophila melanogaster : Untersuchungen am Dlg-Gerüstkomplex mittels hochauflösender Lichtmikroskopie und 3D/4D-Bildanalysen

Abstract

Brain functions, in particular learning and memory, are based on neuronal networks, which, once established are subject to experience-dependent adjustments. Neuronal networks in turn consist of neurons, which are connected with each other via synapses. The latter display plasticity, thereby being challenged by the need for both structural stability and adaptiveness in equal measure. In this regard, membrane-associated guanylate kinases (MAGuKs) are likely to play a pivotal role, as they act as scaffold proteins that determine the molecular architecture of synapses. The functional characterisation of these evolutionarily well-conserved proteins will thus add to a better understanding of brain functions at the cellular and molecular levels and of pathology- and age-related dysfunctions thereof. The larval neuromuscular junction (NMJ) of Drosophila as a widely used, genetically amenable model system for glutamatergic synapses is particularly useful to study the function of the prototypic MAGuK Dlg (Discs large). However, the number of known synaptic interacting partners of Dlg is limited. This work focusses on the interaction of Dlg with the scaffold and adaptor proteins Metro (Ménage à trois) and DLin-7, which are also conserved between vertebrates and invertebrates. Based on mutants and transgenic lines, it is shown that the three proteins are disproportionally interdependent regarding their localisation to NMJs. Postsynaptically, they localise peripheral to rather than within glutamate receptor fields. It is further shown that the complex restricts the size of these receptor fields. To determine the size of the receptor fields in 3D based on light microscopy, a protocol was established, which allows for measuring a large number of receptor fields in a reliable way. Moreover, it is documented that in the absence of Dlg, Metro or DLin-7, synaptic boutons are enlarged, irregularly shaped and often display features of incomplete differentiation, yet with no impact on the overall number of synaptic contacts. An elaborated live-Imaging analysis revealed that the dynamics of Dlg at the NMJ is regulated by its binding to Metro und DLin-7. The turnover rate of Dlg was found to be much lower than previously suggested and hence is likely comparable to the dynamics of glutamate receptors. Of note, it turned out that the expression level of fluorescently labelled Dlg is a critical analysis parameter. Finally, it is shown with unprecedented clarity that Dlg, Metro and DLin-7 are also enriched at the presynaptic membrane, thereby localising close to but not within synaptic release sites. In light of inconsistent findings in the literature, this result supports the assumption for the Dlg complex to play a presynaptic role in addition to the well-documented postsynaptic function.

Hirnfunktionen, insbesondere Lernen und Gedächtnis, beruhen auf neuronalen Netzwerken, die nach ihrer Etablierung bedarfsgerechten Veränderungen unterliegen. Neuronale Netzwerke bestehen aus Neuronen, die über Synapsen untereinander verbunden sind. Letztere zeichnen sich durch eine Plastizität aus, die den Anforderungen an strukturelle Stabilität und funktionelle Anpassungsfähigkeit gleichermaßen genügen muss. Eine wichtige Rolle können hierbei sogenannte Membran-assoziierte Guanylatkinasen (MAGuKs) spielen, die als Gerüstproteine die molekulare Architektur von Synapsen maßgeblich mitbestimmen. Die funktionelle Charakterisierung dieser evolutionär gut konservierten Proteine trägt daher zu einem besseren Verständnis zellulärer Hirnfunktionen sowie deren krankheits- und altersbedingten Störungen bei. Die larvale neuromuskuläre Verbindung (NMJ) von Drosophila, als weithin genutztes, genetisch gut zugängliches Modellsystem für glutamaterge Synapsen, eignet sich gut dafür, da sich an ihr das prototypische MAGuK Dlg (Discs large) anreichert. Allerdings ist die Zahl der bekannten synaptischen Interaktionspartner von Dlg bisher gering. Im Fokus dieser Arbeit steht die Interaktion von Dlg mit den ebenfalls gut konservierten Gerüst- bzw. Adapterproteinen Metro (Ménage à trois) und DLin-7. Anhand von mutanten- und transgenen Tieren wird gezeigt, dass die drei Proteine in einem disproportionalen, wechselseitigen Abhängigkeitsverhältnis an der NMJ lokalisieren. Postsynaptisch lokalisiert der trimere Komplex peripher zu den Glutamatrezeptorfeldern. Es wird weiterhin gezeigt, dass der Komplex die Rezeptorfelder in ihrer Ausdehnung begrenzt. Dafür wurde in dieser Arbeit ein Protokoll ausgearbeitet, mit dem die Rezeptorfelder zuverlässig und in großer Anzahl lichtmikroskopisch in 3D vermessen wurden. Dokumentiert wird ferner, dass die Abwesenheit von Dlg, Metro oder DLin-7 zu strukturellen Abnormitäten und Differenzierungsdefiziten der synaptischen Boutons führt ohne die Zahl synaptischer Kontakte zu beeinträchtigen. Eine differenzierte live-Imaging-Analyse ergab, dass die Dynamik von Dlg an der NMJ durch die Bindung von Metro und DLin-7 reguliert wird. Ferner zeigte sich, dass der Umsatz des Dlg-Komplexes an der NMJ niedriger ausfällt als bislang angenommen und somit wohl der Dynamik von Glutamatrezeptoren vergleichbar ist. Das Expressionslevel des Fluoreszenz-markierten Dlg erwies sich dabei als kritischer Analyseparameter. Schließlich wird in dieser Arbeit erstmals deutlich gezeigt, dass Dlg, aber auch Metro und DLin-7, präsynaptisch angereichert sind und dabei peripher zu den synaptischen Zonen der Neurotransmitterfreisetzung lokalisiert sind. Mit Blick auf teils widersprüchliche Befunde in der Literatur, unterstützt dieser Ergebnisteil die Annahme, dass der Dlg-Komplex neben seiner Funktion in der Postsynapse auch in der Präsynapse eine Rolle spielt.