TFF2 (Trefoil Factory Family 2) im Magen von Mensch und Schwein : Charakterisierung der Bindung des Peptids TFF2 an den Mukus

Abstract

Der Gastrointestinaltrakt von Mensch und Schwein wird durch ein komplexes Gel, die sogenannte Mukusschicht, ausgekleidet. Diese schützt die Epithelschicht der Organe vor enzymatischem Abbau durch Verdauungsenzyme, wie z. B. Proteasen. Hauptbestandteil dieser Schutzschicht sind neben Wasser (ca. 95%) vor allem Muzine. Im Magen und Darm werden diese Muzine zusammen mit verschiedenen Trefoil factor family (TFF)-Peptiden sezerniert. TFF2, welches vor allem im Magen vorkommt, bindet lektinartig an das Muzin MUC6, mit welchem es zusammen von Nebenzellen des Korpus und Antrumdrüsenzellen sezerniert wird. In dieser Arbeit wurden zunächst Magenproben von Mensch und Schwein über FPLC (S-75HL, S-500, ResQ) gereinigt. Im menschlichen Magen konnte TFF2 sowohl in einer hochmolekularen Form, als auch in einer niedermolekularen Form (monomeres TFF2) nachgewiesen werden. Bei der hochmolekularen Form handelt es sich um TFF2, welches mit den Muzinen der Mukusschicht interagiert. Diese Bindung von TFF2 an den Mukus wurde im Folgenden untersucht (SDS-PAGE, Western Blot) und näher charakterisiert (stufenweise Extraktion, Hybridisierung mit 125I-TFF2 unter verschiedenen Bedingungen, Kochexperimente mit verschiedenen Detergenzien). Zusätzlich wurde auch die Bindung von TFF2 an Muzine bei Mensch und Schwein gegenübergestellt. Durch die genannten Methoden konnte gezeigt werden, dass TFF2 im humanen Magen abhängig vom pH-Wert und der Konzentration der Ca2+-Ionen an das Muzin MUC6 bindet. Diese Bindung kann durch GSAII, HIK1083 sowie den Zucker β-Methylgalaktosid tlw. inhibiert werden. Für die Bindung von TFF2 an Muzine sind also, sowohl α-1,4-GlcNAc Einheiten, als auch β-Galaktosid-Reste essentiell. Da die Bindung nach Kochen der Mukusproben mit SDS und EDTA sowie nach TRIzol®-Extraktion im Mensch nicht mehr beobachet werden kann, handelt es sich hier vermutlich um eine nicht-kovalente Bindung. Es konnten einige Unterschiede der Bindung von TFF2 an Muzine zwischen Mensch und Schwein herausgearbeitet werden (z. B. im Mensch nicht kovalent, im Schwein vermutlich tlw. kovalent). Auf Grund der erzielten Ergebnisse kann eine Rolle von TFF2 bei der Stabilisierung der Mukusschicht (als Quervernetzter von MUC6) vermutet werden.

The gastrointestinal tract of humans and pigs is lined by a complex gel, the so-called mucus layer. This mucus layer protects the epithelial cells from enzymatic degradation by digestive enzymes such as proteases. The main component of this protective layer is water (approx. 95%). Mucins are also a component of the mucus layer. In the stomach and intestine these mucins are secreted together with various Trefoil factor family (TFF) peptides. TFF2, which is mainly found in the stomach, binds lectin-like to the mucin MUC6. In this work, gastric tissue samples from human and pig were purified by FPLC (S-75HL, S-500, ResQ). In the human stomach TFF2 could be detected as a high molecular form as well as a low molecular form (monomeric TFF2). The high-molecular form interacts with mucins of the mucosal layer. The nature of this bound was studied (SDS-PAGE, Western blot) and characterized in more detail (stepwise extraction, binding studies 125I-TFF2 under different conditions, boiling experiments with different detergents). Additionally, the interaction of TFF2 to mucins in humans and pigs was analysed. Using the methods mentioned above, it could be shown that TFF2 in the human stomach binds to the mucin MUC6 depending on the pH value and concentration of Ca2+ ions. This binding can be partially inhibited by GSAII; HIK1083 and the sugar β-methylgalactoside. Thus, both α-1,4-GlcNAc-residues and β-galactoside residues are essential for the bond of TFF2 to mucins. Since the binding can no longer be observed after boiling the mucus samples with SDS and EDTA, as well as after TRIzol® extraction, it can be characterised as a non-covalent binding. Some differences in the binding of TFF2 to mucus between human and pig could be found (e.g. non-covalent in humans, partly covalent in pigs). Based on the results obtained, TFF2 probably plays an important role in the stabilization of the mucus layer by cross-linking MUC6.