Development of a CRISPR-imaging toolset for imaging of genomic loci in living plants

Abstract

Die Entwicklung von Live-Imaging-Techniken, die Informationen darüber liefern, wie Chromatin in lebenden Zellen organisiert ist, ist entscheidend für die Entschlüsselung der Regulation biologischer Prozesse. Hier wird die Verbesserung einer Live-Imaging-Technik auf Basis von CRISPR/dCas9 demonstriert. Bei diesem Ansatz wurde das sgRNA-Gerüst mit RNA-Aptameren wie MS2 und PP7 fusioniert. Wenn inaktives Cas9 (dCas9) zusammen mit der chimären sgRNA exprimiert wird, werden die mit fluoreszierendem Hüllprotein markierten MS2- und PP7-Aptamere (tdMCP-FP und tdPCP-FP) an die Zielsequenz rekrutiert. Im Vergleich zu früheren Arbeiten mit dCas9:GFP wird gezeigt, dass die Qualität der Telomermarkierung in transient transformierter Nicotiana benthamiana mit Aptamer-basierten CRISPR-Konstrukten verbessert wurde. Die Markierung wird von der Kopienzahl der Aptamere und weniger von den Promotortypen beeinflusst. Die gleichen Konstrukte waren für die Markierung von DNA-Repeats in stabil transformierten Pflanzen und Wurzeln nicht anwendbar. Es wird angenommen, dass die ständige Interaktion des RNP-Komplexes mit seiner Ziel-DNA zelluläre Prozesse stört.

The development of live imaging techniques for providing information how chromatin is organized in living cells is pivotal to decipher the regulation of biological processes. Here, we demonstrate the improvement of a live imaging technique based on CRISPR/dCas9. In this approach, the sgRNA scaffold is fused to RNA aptamers including MS2 and PP7. When the dead Cas9 (dCas9) is co-expressed with chimeric sgRNA, the fluorescent coat protein-tagged for MS2 and PP7 aptamers (tdMCP-FP and tdPCP-FP) are recruited to the targeted sequence. Compared to previous work with dCas9:GFP, we show that the quality of telomere labelling was improved in transiently transformed Nicotiana benthamiana using aptamer-based CRISPR-imaging constructs. Labelling is influenced by the copy number of aptamers and less by the promoter types. The same constructs were not applicable for labelling of repeats in stably transformed plants and roots. The constant interaction of the RNP complex with its target DNA might interfere with cellular processes.