Darstellung und Charakterisierung der humanen 3‘-Prozessierungsfaktoren mPSF und CF II

Abstract

Reife mRNAs werden in eukaryotischen Zellen in mehreren Schritten aus Vorläufern generiert. Das primäre Transkript wird dabei u.a. durch eine Endonuklease gespalten und danach polyadenyliert. Vier Komplexe sind maßgeblich an der Erkennung der Substrat-RNA beteiligt. Der Cleavage and polyadenylation specificity factor (CPSF) bildet den zentralen Komplex der 3‘-Prozessierung. Die Arbeit zeigt, dass in dem CPSF-Subkomplex mammalian Polyadenylation specificity factor (mPSF) die Proteine CPSF4 und WDR33 das Polyadenylierungssignal binden, nicht jedoch CPSF1. Der 3‘-Prozessierungskomplex CF II wurde in der Arbeit erstmals aus hClp1 und hPcf11 rekonstituiert. Die 5‘-Polynukleotidkinase-Aktivität des hClp1 wurde beschrieben. Clp1 wird im Komplex stabilisiert und der KM (ATP) verringert. Das hPcf11 wurde erstmals in der RNA-Bindung an G-reiche RNAs beschrieben und ein Bindungsmotiv ermittelt.

In eukaryotes mRNAs are generated in a multi-step reaction of which the cleavage of the pre-mRNA by an endonuclease followed by polyadenylation is one. The cleavage site recognition and reaction are carried out by a multimeric protein complex with four main factors known to define the cleavage site. The Cleavage and Polyadenylation Specificity Factor (CPSF) is the core complex of the 3’ processing reaction. It could be shown that the proteins CPSF4 and WDR33 of a CPSF-subcomplex, the mammalian Polyadenylation specificity factor (mPSF), bind the polyadenylation signal. The 3’ processing factor CF II could be reconstituted from hClp1 and hPcf11 for the first time. The 5’-PNK activity of hClp1 was characterized. Clp1 was stabilized in complex with hPcf11 and showed a lowered KM (ATP) in CF II. Human Pcf11 was shown to bind G-rich RNAs. A binding motif was derived from selection experiments.