Prokaryotische Expression, in vitro-Faltung und Rekonstitution des Neuropeptid Y-Rezeptors Typ 2 für NMR-Strukturanalysen

Abstract

G-Protein gekoppelte Rezeptoren (GPCRs) sind essentiell in einer Vielzahl von Signal-übertragungswegen und repräsentieren daher ein lohnendes Ziel für pharmazeutische Studien. Für strukturbasierte Medikamentenentwicklung sind Daten zur Struktur und Dynamik von GPCRs, wie sie die NMR-Spektroskopie liefern kann, Grundvoraussetzung. In dieser Arbeit wurden Protokolle zur prokaryotischen Expression, zur Reinigung, zur in vitro Faltung und zur Rekonstitution des Klasse A G-Protein gekoppelten Y-Rezeptors Typ 2 entwickelt, mit der Rezeptorproben in einer Qualität und Quantität hergestellt werden können, die Untersuchungen mittels der NMR-Spektroskopie ermöglichen. In der Expression wurden Ausbeuten von >15 mg hochreinen, 15N-markierten Rezeptoren/Liter Medium erreicht. Nach Reinigung und Faltung des GPCRs in einer Detergensumgebung konnte eine Liganden-affinität von 1,9 nM gezeigt werden. Die Stabilisierung der nativen Struktur in hoher Konzentration erfolgte in Phospholipidmembranen.