Untersuchung der für einen Tat-Transport in Escherichia coli erforderlichen Substrateigenschaften

Abstract

Das Tat-System (twin-arginine translocation) ist ein Protein-Transportsystem, welches die Translokation von gefalteten Proteinen über biologische Membranen ermöglicht. Das Wissen über den notwendigen Faltungszustand der Tat-Substrate ist fundamental wichtig für die Aufklärung des Transport-Mechanismuses. In Escherichia coli ist das Tat-System nicht in der Lage PhoA (Alkalische Phosphatase) fusioniert an ein Tat-Signalpeptid (RR-PhoA) zu transportieren, da PhoA die Bildung von Disufid-Brücken zur Faltung benötigt. Diese Arbeit zeigt, dass ein effizientes Targeting eines solchen RR-PhoA-Konstruktes zum Tat-Translokon möglich ist, der Transport aber nicht vollständig abläuft. RR-PhoA ist detektierbar in einem 580 kDa TatBC-enthaltenden Komplex. Ein zweiter TatBC-Komplex bei 440 kDa enthält kein RR-PhoA. Das Targeting von PhoA zum Tat-Translokon ist abhängig vom twin-arginine-Motiv und hat eine deutliche Wachstumsinhibition zur Folge. Dieser physiologische Effekt ist wahrscheinlich auf ein Protonen-leakage an der Cytoplasmamembran zurückzuführen. Die vorliegende Arbeit zeigt mittels der natürlich ungefalteten FG-repeats des Nucleoporins Nsp1p aus Hefe, fusioniert an ein Tat-Signalpeptid, einen Tat-Transport von völlig unstrukturierten Proteinen. Der Transport der ungefalteten Proteine wird ineffizienter mit der Länge der Konstrukte. Die Einführung von sechs Aminosäureresten aus dem hydrophoben core-Bereich eines globulären Proteins blockierte den Transport vollständig, was darauf hinweist, dass hydrophile Oberflächen eine Voraussetzung für den Tat-Transport sind. Die physiologischen Daten lassen vermuten, dass exponierte hydrophobe Bereiche den Transport zu einem späten Zeitpunkt, wahrscheinlich durch Interaktion mit der Membran, abbrechen lassen. Die Ergebnisse zeigen, dass eine intrinsische Qualitätskontrolle der Faltung am Tat-System selber nicht existiert und deuten auf eine Inkompatibilität des Tat-Systems mit langen ungefalteten Proteinen und mit Proteinen mit exponierten hydrophoben Oberflächen hin.