Katalyse und Regulation der E1-Komponente des humanen Pyruvat-Dehydrogenase-Komplexes auf molekularer Ebene

Abstract

Der Pyruvat-Dehydrogenase-Komplex (PDH-Komplex) gehört zur Familie der α-Ketosäure-Dehydrogenase-Komplexe und ist eines der größten Multienzymsysteme, das in der Natur zu finden ist. Der Enzymkomplex katalysiert die oxidative Decarboxylierung von Pyruvat zu Acetyl-CoA. Diese Reaktion wird in allen Komplexen von mehreren Kopien dreier Enzyme realisiert, die Thiamindiphosphat (ThDP)-abhängige Pyruvat-Dehydrogenase (E1), die Dihydrolipoamid-Acetyltransferase (E2) und die FAD-abhängige Dihydrolipoamid-Dehydrogenase (E3). Aufgrund seiner zentralen Rolle im Glukosestoffwechsel, ist eine strenge Regulation des PDH-Komplexes auf verschiedenen Ebenen des Stoffwechsels notwendig. Im Rahmen dieser Doktorarbeit wurden die Reaktion und die Regulation der humanen E1-Komponente analysiert. Die durchgeführten 1H-NMR-Experimente konnten erstmals für ein ThDP-abhängiges Enzym chemische Nichtäquivalenz der beiden aktiven Zentren (Halbzentrenaktivität) auf mikroskopischer Ebene für sowohl für die Aktivierung des Cofaktors ThDP als auch für die Bildung des Intermediats 2-Hydroxyethyl-ThDP aus Pyruvat nachweisen. Des Weiteren wurde die zweite Halbreaktion der E1-Komponente, die reduktive Acetylierung der Lipoyldomäne 2 der humanen E2-Komponente, durch die Etablierung eines spektroskopischen Aktivitätstests charakterisiert. Die humane E1-Komponente wird im Organismus durch die Phosphorylierung dreier Serinreste reguliert. Zur Untersuchung der Mechanismen der Regulation dienten Pseudophosphorylierungsvarianten, bei denen das Serin durch ortsgerichtete Mutagenese durch Glutamat ersetzt wurde. Die experimentellen Daten deuten daraufhin, dass die Phosphorylierung des Serinrestes 264 zu einer Blockierung des Substratkanals des Enzyms führt, was eine Inaktivierung des Gesamtkomplexes zur Folge hat.