Strategies for production of a recombinant single chain antibody fragment in Escherichia coli

Abstract

Ein Thema dieser Doktorarbeit war die Etablierung und Optimierung der Produktion eines Einzelketten-Antikörper-Fragmenten gegen das Hapten Oxazolon (scFvOx) im Periplasma. Weiterhin sollten neue Rückfaltungsstrategien für dieses Modellprotein nach seiner Expression in zytoplasmatische inclusion bodies untersucht werden. Es ist gelungen, scFvOx im Periplasma zu produzieren. Das Protein wurde effizient in das Periplasma befördert. Die Expression unter Kontrolle des lac-Promoters verlief kontinuierlich und beeinträchtigte die Physiologie des Wirtsorganismus nicht negativ. Es konnten keine inclusion bodies in den Zellen nachgewiesen werden. Das periplasmatisch exprimierte scFvOx war biologisch aktiv. Der Effekt der Promotorstärke auf die Expression wurde untersucht. Der Einsatz des sehr sträken T7 Promotors führte zu sehr hohen Produktbildungsraten, wodurch es zu einer negativen Beeinträchtigung der Zellphysiologie kam. Die Koexpression Disulfideisomerase DsbA und von zwei ihrer aktiven Zentrum mutierten Varianten erwies sich entgegen den Erwartungen als nicht hilfreich für die Produktion von scFvOx. Im Bioreaktor wurde bei einer spezifischen Wachstumsrate (μset) von 0,06 h-1 eine längere Produktionsphase von scFvOx erreicht als bei einer spezifischen Wachstumsrate von 0,12 h-1. In den späten Kultivierungsphasen kam es in beiden Fällen zum Verlust des Produktes. Weiterhin wurde die Rückfaltung von scFvOx aus zytoplasmatischen inclusion bodies untersucht. Zu diesem Zweck wurden die Einflüsse von ionischen Flüssigkeiten (IL), aus der Klasse der von N-Alkyl-N’-Methylimidazoliumchloride auf die Rückfaltung getestet. Diese IL unterdrückien die Aggregation und führen somit zu einer erhöhten Rückfaltungsausbeute. Weitere IL mit verschiedenen Kationen und Anionen wurden ebenfalls getestet. NHydroxyethylpyridiniumchlorid erwies sich als effektives Additiv für die Rückfaltung von scFvOx, während N-Alkyl-N’-Methylimidazoiumderivate mit Dialkylphosphat- bzw. Ethylsulfat-Anionen weniger förderlich für die Renaturierung waren. Die Stabilität von scFvOx gegenüber chemischer Denaturierung und pH wurde untersucht. Die Stabilität des Proteins war zwischen pH 6,0 und pH 7,0 am größten. Die chemische Denaturierung bei pH 8,5 war weniger reversibel als bei pH 7,0. Bei pH 2,0 konnte ein säureinduzierter Konformationszustand beobachtet werden. Dieser Zustand wird charakterisiert durch einen hohen Sekundässtruktur-anteil und apparente thermodynamische Stabilität. Die pH-Abhängigkeit der Renaturierung von scFvOx ausgehend sowohl von reduziert denaturiertem Protein als auch vom gemischten Disulfid mit Glutathion spiegelt die pHabhängige Stabilität des Proteins wieder. Die höchsten Ausbeuten der Rückfaltung wurden dabei zwischen pH 6,0 und 7,0 erzielt. Weiterhin wurden aromatische Thiolverbindungen als neuartige Redoxreagentien für die oxidative in vitro-Rückfaltung von scFvOx getestet. Die untersuchen aromatischen Thiole verbesserten mit einer Ausnahme die Ausbeuten der Renaturierung gegenüber der Rückfaltung in Gegenwart von Glutathion. Während Thiosalicylsäure die Rate der Renaturierung um das zweifache beschleunigte, wurde ein solcher Effekt für die untersuchten heteroaromatischen Verbindungen nicht beobachtet. Die Ergebnisse dieser Untersuchungen sollten sich für die Zukunft sowohl für die Verbesserung der periplasmischen Produktion von Antikörperfragmenten als auch für die Erarbeitung optimierter Rückfaltungsprotokolle für inclusion body-Material bei physiologischen pH-Werten als hilfreich erweisen.