Development and characterization of controlled delivery systems for rhBMP-2

Abstract

Unphysiologisch hohe Dosen des Wachstumsfaktors rhBMP-2 sind derzeit noch nötig, um beim Menschen klinische relevante Effekte zu erzielen. Der Hauptgrund für die geringe Effizienz der Behandlung wird in einer unzureichen¬den Freigabekontrolle des in vivo kurzlebigen Wachstumsfaktors gesehen. Ziel der vorliegenden Arbeit war es, Systeme zur kontrollierten Freigabe rhBMP-2 zu entwickeln und zu charakterisieren. Nach der Isolation, Aufreinigung und Faltung wurde rhBMP-2 in Mikropartikel formuliert. Orientierende Arbeiten zur Stabilität von rhBMP-2 unter Verwendung von MALDI-TOF-MS, AF4, UV-Spektro¬skopie, NTA und PCS wurden durchgeführt. Mikropartikel aus verschiedenen PLGA-Derivaten wurden hinsichtlich ihrer Morphologie (ESEM), ihrer Größenverteilung und ihres Quellungs¬vermögens (ESEM und LD), Abbau¬verhaltens (1H-NMR und pH), etwaiger Lösungsmittelrückstände (GC-FID), ihrer Wirkstofffreigabe (ELISA) und ihrer in vitro-Aktivität (ALP-Assay) charakterisiert. Nach kovalenter Fluoreszenzmarkierung wurde die Verteilung von rhBMP-2 in den Partikeln in Abhängigkeit der Formulierung untersucht (CLSM). Der Einfluss von PEG 300 auf o.g. Parameter wurde evaluiert. Die Kombinierbarkeit der Mikropartikel mit Gerüstmatrices und Gelen wurde nachgewiesen. Ausgewählte Formulierungen wurden in vivo in einem Mausmodell hinsichtlich ihrer Fähigkeit ektoper Knocheninduktion getestet. Zur Verfolgung der Calcifizierung wurden erstmalig Fluoreszenztechniken und BT-MRI angewendet. Die erzielten Ergebnisse wurden mittels CT und histologischer Evaluierung der Explantate bestätigt. Es wurden mehrere kontrollierte Freigabesysteme für rhBMP-2 entwickelt und erfolgreich in vitro und in vivo getestet. Es konnte gezeigt werden, dass die Kombination von PEP 5-mikroverkapseltem rhBMP-2 mit chitosanbasierten, sich in situ-bildenden Implantaten ein sehr effektives Freigabesystem darstellt und damit einen Beitrag zur Verringerung der benötigten rhBMP-2-Menge leisten kann.

The application of the bone growth factor rhBMP-2 still requires supraphysiological doses to obtain satisfactory clinical results. The main reason for the low efficiency of current treatments is supposed to be an insufficient control of the release of the growth factor in vivo. It was the aim of the current study to develop and characterize controlled delivery systems for rhBMP-2 to contribute to dose reduction of the expensive protein. After isolation, purification and folding, the stability of rhBMP-2 was investigated in preliminary studies by means of MALDI-TOF-MS, AF4, UV spectroscopy, NTA and PCS. RhBMP-2 was incorporated into microspheres which had been developed for this purpose. The microspheres composed of different PLGA/PEG-PLGA derivatives were characterized thoroughly with respect to their morphology (ESEM), size distribution and swelling behaviour (ESEM and LD), in vitro degradation (1H-NMR and pH), potential residual solvents (GC-FID). Their growth factor release pattern was determined (ELISA), as well as the activity of the released growth factor in vitro (ALP assay). After covalent labelling of rhBMP-2 with a fluorescent dye, the distribution of rhBMP-2 within the microspheres was investigated with respect to the different formulations (CLSM). The influence of the cosolvent PEG 300 on the aforementioned parameters was evaluated. The combineability of microspheres with scaffold matrices and with gel and in situ forming implant systems was demonstrated. Selected formulations were tested in vivo in a mouse model for their ability to induce ectopic bone formation after subcutaneous application. For the first time, fluorescence techniques and BT-MRI were applied for the monitoirng of calcification processes in vivo. The obtained data were verified by means of CT and histological evaluation of the explants. Several controlled delivery systems for rhBMP-2 were developed and tested successfully in vitro and in vivo. It was demonstrated that a combination of rhBMP-2 encapsulated in PEP 5 microspheres and dispersed in chitosan-based in situ-forming implants is a very efficient release system and thus may well contribute to the necessary reduction of the required rhBMP-2 dose.