Analyse von Änderungen der Genexpression mikrovaskulärer Endothelzellen im pro-inflammatorischen Milieu : Gegenüberstellung von relativer und absoluter Quantifizierung

Abstract

In der Studie wurden zwei PCR-Methoden verwendet und verglichen: Die qPCR und die ddPCR. Der Vergleich der qPCR und der ddPCR basierte auf einem Stimulationsansatz mikrovaskulärer Endothelzellen, bei dem die Wirkung eines proinflammatorischen Milieus auf die Expression vasoaktiver Rezeptoren und weitere Zielgene untersucht wurde. Bei den meisten Genen war die Richtung der Wirkung konsistent. Beim Effektausmaß zeigten sich Abweichungen zwischen den Ergebnissen der Quantifizierungsmethoden, wenn die Messwerte an den äußeren Bereichen der dynamischen Reichweite der Testverfahren lagen. Um valide Ergebnisse zu erhalten, werden Verdünnungsreihen empfohlen. Bei der ddPCR sollte die Anzahl der Kopien pro μl auf den niedrigen dreistelligen Bereich eingestellt werden. Im Hinblick auf die qPCR ist es essentiell, dass die Zuverlässigkeit der verwendeten Referenzgene gewährleistet ist. Im Hinblick auf wirtschaftliche und zeitliche Faktoren sollten strenge Indikationen für diese Methodik gestellt werden.

In the study, two PCR methods were used their results were compared: qPCR and ddPCR. The comparison of the qPCR and the ddPCR was based on a stimulation approach of microvascular endothelial cells in which the effect of a pro-inflammatory milieu on the expression of vasoactive receptors and different pro-inflammatory targets was investigated. There was consistency in directions of effects for the majority of genes tested. It was striking that deviations in the dimension of the effects were more pronounced if the measured values were on the extreme edges of the dynamic range of the test procedures. To obtain valid results, dilution series are recommended, which should be carried out initially. In case of ddPCR the number of copies per μl should be adjusted to the low three-digit range. With regard to qPCR it is essential that the stability of the reference genes used is guaranteed. Here, ddPCR offers the advantage that housekeeping genes are not required. Strict indications for this methodology should also be made with regard to economic and timing factors.