Untersuchungen zur Substrat- und Spaltspezifität einer insulinspaltenden Membranprotease (ICMP, Imelysin) von Pseudomonas aeruginosa und einer caseispaltenden Membranprotease (CCMP, Camelysin) von Bacillus cereus

Abstract

Zielsetzung: Das Ziel der vorliegenden Arbeit war die Bestimmung der Substrat- und Spaltspezifität einer insulinspaltenden Membranprotease von Pseudomonas aeruginosa (Imelysin, ICMP) und einer caseinspaltenden Membranprotease (Camelysin, CCMP) von Bacillus cereus, um daraus Aussagen über ihren möglichen Einfluss auf die Pathogenität ableiten zu können. Methoden: Die Spaltstücke beim Abbau der Insulin A- und B-Kette durch die beiden Enzyme wurden durch Trennung mittels HPLC und massenspektrometrischer Untersuchungen identifiziert. Die Spaltung chromogener und fluorogener Substrate wurde untersucht. Weiterhin wurde die Wirkung der Proteasen auf zahlreiche Proteine getestet und mittels SDS-Gelelektrophorese sichtbar gemacht. Ergebnisse: Für die ICMP wurden in der Insulin B-Kette zwei primäre und zwei sekundäre Spaltstellen gefunden, bei denen sich große Aminosäuren mit aromatischen (Tyr, His, Phe) oder sauren Seitenketten (Glu) in der P1-Position und hydrophobe Aminosäuren mit aliphatischen Seitenketten, mit Ausnahme des Tyrosin in einer der sekundären Spaltstellen, in der P1’-Position befinden. Von den getesteten p-Nitroanilid-Substraten wurden Substrate von Thrombin, Faktor Xa, Plasmin und Plasminogenaktivator gespalten. Von den getesteten fluorogenen Substraten wurde das Thrombinsubstrat mit der höchsten Aktivität gespalten. Die ICMP besitzt proteolytische Aktivität gegenüber Aktin, Casein, Globin und Laktoferrin. Außerdem fand sich fibrinogenolytische Aktivität mit einem spezifischen Abbau der a-und b-Ketten von Fibrinogen durch die ICMP. Die CCMP spaltet die Insulin A- und B-Kette. Es fanden sich jeweils vier Spaltstellen, wobei bevorzugt Peptidbindungen zwischen zwei aliphatischen Aminosäuren oder zwischen zwei Aminosäuren mit einer hydrophilen Seitenkette (-OH, -SH, -CONH2) oder Peptidbindungen zwischen je einer Aminosäure dieser beiden Gruppen gespalten werden. Bei den getesteten fluorogenen Substraten besitzt die CCMP hohe Aktivität gegenüber den Substraten der Matrixmetalloproteasen 2 und 7. Die CCMP führt zu einem Abbau von Aktin, a1-Antitrypsin, a2-Antiplasmin, humanem Serumalbumin, Globin, Kollagen Typ I und Lactoferrin. Sie zeigte außerdem fibrinogenolytische und fibrinolytische Aktivität. Mit Plasminogen und Antithrombin III kommt es zur Bildung von unter SDS stabilen Komplexen. Folgerungen: Als Membranprotease mit fibrinogenolytischer Aktivität könnte die ICMP als Pathogenitätsfaktor von Pseudomonas aeruginosa eine Rolle spielen. Für die CCMP ist aufgrund ihrer Substratspezifität und Interaktionen mit Proteinen des Blutgerinnungs- und fibrinolytischen Systems, der Extrazellulärsubstanz und Proteaseinhibitorsystemen eine Bedeutung bei Pathogenität und Ausbreitung von Bacillus cereus anzunehmen.