Accessing novel activities and selectivities of haem-dependent enzymes by high-throughput methodologies [Kumulative Dissertation]

Abstract

Die gerichtete Evolution, als Laborstrategie, ahmt die natürliche Evolution durch iterative Zyklen genetischer Diversifizierung kombiniert mit einem Bibliotheks-Screening/Selektion nach, um so Enzyme mit einer gewünschten katalytischen Funktion zu entwickeln. In dieser Arbeit wurden zwei Häm-abhängige Enzymklassen als Katalysatoren für anspruchsvolle C‒H-Funktionalisierungen eingesetzt. Das durchgeführte Protein Engineering erforderte die Entwicklung und Anwendung von Hochdurchsatztechniken, die zur Identifizierung von verbesserten Enzymvarianten führten. Dadurch wurden mittels des E. coli Proteins YfeX Tryptaminderivate zugänglich gemacht. Im weiteren ermöglichten Enzymvarianten der unspezifischen Peroxygenase aus Myceliophthora thermophila (MthUPO) den Zugang zu verbesserten Chemo- und Regioselektivitäten von benzylischen, aromatischen und terminalen Oxidationen, um so das Selektivitätsproblem dieser Enzymklasse zu bewältigen.

Directed evolution, as a laboratory strategy, mimics the natural evolution by iterative rounds of genetic diversification and library screening or selection to evolve enzymes towards a desired catalytic function. In this thesis, two haem-dependent enzyme classes were utilised as catalysts for challenging C‒H functionalisations. The implemented protein engineering required the development and application of high-throughput techniques, which resulted in the identification of enhanced enzyme variants. Thereby, the E. coli protein YfeX enabled the access to tryptamine derivatives. In addition, enzyme variants of the unspecific peroxygenase from Myceliophthora thermophila (MthUPO) exhibited enhanced chemo- and regioselectivities of benzylic, aromatic and terminal oxidations addressing the selectivity problem of this enzyme class.