Strukturelle und thermodynamische Charakterisierung der DltA-DltC-Interaktion und kinetische Analyse der DltA katalysierten D-Alanylierung des DltC

Abstract

Die D-Ala-Modifikation von Lipoteichonsäuren in gram-positiven Bakterien, die durch die Proteine des dlt-Operons realisiert wird, ist notwendig zur Anpassung an sich ändernde Umweltbedingungen. DltA katalysiert in einer ATP-abhängigen Reaktion die Aktivierung und Übertragung des D-Alanins auf das carrier-Protein DltC. Drei DltA-Konformationen in Abhängigkeit des gebundenen Nukleotides wurden identifiziert und zwei Kristallstrukturen des DltA:DltC-Komplexeskonnten gelöst werden. Die erste Struktur repräsentiert einen produktiven Komplex. Die zweite Struktur zeigt eine alternative Bindestelle für DltC an der großen DltA-Domäne, weit entfernt vom aktiven Zentrum ohne Elektronendichte für den Cofaktor. Identifikation der an der Interaktion beteiligten DltC-Aminosäuren mittels NMR-Titration belegt ein mögliches Vorkommen beider Varianten in Lösung. Anhand quantitativer Protein-Protein-Interaktionsstudien sowie umfangreicher kinetischer Analysen konnte jedoch keine mögliche Funktion der alternativen Bindung in vitroidentifiziert werden.

The D-Ala-modification of lipoteichoic acidsof gram positive bacteria, which is carried out by proteins of the dlt-operon, is necessary to adopton changing environmental conditions. DltA catalyse the activation of D-alanine by ATP to D-Ala-adenylate and the subsequent transfer of the D-Ala to the carrier protein DltC. At least three DltA conformations could be identified that were dependent on the associated nucleotide. Two crystal structures of the DltA:DltC complex could be solved. The first structure represents a productive complex. The second one shows an alternative binding site for DltC on the large domain of DltA far away from the active centre, with no apparent electron density for the cofactor.Mapping of the DltC interaction surface monitored by NMR titration provides support for both interaction interfaces in solution, butquantitative protein-protein interaction studies and extensive enzyme kinetic analysis could not reveal a possible function of this alternative binding in vitro.