Die Prodomäne des Knochenwachstumsfaktors GDF5 - biophysikalische Charakterisierung und Untersuchung krankheitsassoziierter Varianten

Abstract

Es besteht ein stets wachsendes Interesse an der therapeutischen Nutzung von Knochenwachstumsfaktoren. Um die häufig dabei auftretenden Nebenwirkungen, die vermutlich auf einer Überdosierung beruhen, zu umgehen, könnten transient inaktive Proproteine als natürliche Retardformen einen Lösungsansatz darstellen. Eine Aufklärung der Struktur und eine eingehende Charakterisierung der Prodomänen dieser Wachstumsfaktoren sollen deren Funktionsweise erklären und sind für die therapeutische Nutzung wichtig. Über die Struktur und die biologische Funktion der Prodomäne des in dieser Arbeit untersuchten Knochenwachstumsfaktors GDF5 war zu Beginn nahezu nichts bekannt. In der vorliegenden Dissertation wurden Erkenntnisse zu Struktur und Thermodynamik der Prodomäne von GDF5 gewonnen, indem sowohl die Prodomäne selbst, als auch ein proteolyse-stabiles Fragment eingehend untersucht wurden. Die reversibel faltende Prodomäne bildete einen affinen nicht-kovalenten Komplex mit GDF5 und zeigte durch die Bindung an den reifen Teil sowohl eine Induktion von Strukturelementen als auch eine thermodynamische Stabilisierung. Das untersuchte Fragment stellt eine unabhängig und reversibel faltende Subdomäne mit einem im Vergleich zur Prodomäne erhöhten Anteil an definierten Sekundärstrukturen dar und bildet wahrscheinlich den strukturellen Kern der Prodomäne. Dieses Kernfragment wurde erfolgreich bei NMR-spektroskopischen Untersuchungen eingesetzt. Weiterhin wurden in dieser Dissertation zwei krankheitsassoziierte Prodomänenvarianten untersucht, die einen Eindruck über die durch die Aminosäureaustausche hervorgerufenen Veränderungen in der Prodomäne erlauben. Trotz nur geringer struktureller Unterschiede innerhalb der Prodomänen wiesen die Varianten teilweise deutliche Veränderungen bezüglich der thermodynamischen Eigenschaften und der GDF5-Bindung auf.

There is a growing interest in the therapeutical use of bone growth factors. To avoid often occurring side effects, probably caused by overdoses, transiently inactive proproteins are being considered as improved late acting drugs. The elucidation of the structure and a detailed biochemical characterization of the prodomains of these growth factors allows insight into their mode of action and will be helpful in therapeutical use. At the beginning of these studies little knowledge existed as to the structure and biological function of the GDF5 prodomain. In the documented results in the form of dissertation, findings about structure and thermodynamics of the prodomain of GDF5 are summarized. The work presents a detailed analysis of the prodomain itself and a proteolytically stable fragment thereof. The reversibly folding prodomain forms a high affinity, non-covalent complex with mature GDF5 and shows both an induction of structural elements and a thermodynamical stabilization upon binding to GDF5. The investigated fragment represents an independently and reversibly folding subdomain with an increased contribution of secondary structure elements compared to the complete prodomain. The fragment probably forms the structural folded core of the prodomain. This core fragment was successfully used for NMR measurements. Furthermore, two disease-specific prodomain variants were investigated in the dissertation to get information about the disease causing changes in the prodomain induced by the amino acid exchanges. Despite of only minor structural differences within the prodomains, the variants displayed altered thermodynamic properties and impaired GDF5 binding.