Struktur-Funktionsbeziehungen des humanen P2X7-Rezeptors Untersuchungen mittels Cysteinmutagenese und Patch-clamp-Technik

Abstract

Die humanen P2X7-Rezeptoren (hP2X7R) sind ATP-gesteuerte Kationenkanäle, die in Immunzellen exprimiert werden, in denen sie immunologische und Entzündungsreaktionen auslösen. Übereinstimmend mit der 3D-Struktur des P2X4 des Zebrafisches, weisen die hP2X7-Untereinheiten eine große Extrazellulardomäne, zwei Transmembrandomänen und intrazellulär gelegene N-und C-Termini auf. Die zweite Transmembrandomäne (TM2) ist in die Ionenpermeation und der Kanalöffnung der P2X Rezeptoren beteiligt. Zur Untersuchung der Funktion der TM2 wurde eine biochemische und funktionelle Cysteine-Scanning-Mutagenese durchgeführt unter Nutzung der Ganzzellspannungsklemme mit Applikation von Methanthiosulfonaten (MTS), die kovalent an die eingeführten Cysteinreste in der TM2 binden. Dazu wurden Oozyten vom Xenopus laevis mit cRNA der verschiedenen hP2X7R Konstrukte injiziert und die ATP-abhängigen Ströme gemessen. Durch Nutzung verschiedener MTS wurde der Selektionsfilter C-terminal zur S342 gefunden. In Abwesenheit von ATP zeigten Applikation von MTSEA+, dass das Gate, das für das Öffnen und Schließen verantwortlich ist, C-terminal zur S339 liegt.

The human P2X7 receptors (hP2X7R) are ATP-gated cation channels expressed in immune cells where they modulate immunological and inflammatory processes. According to the recently dissolved three-dimensional structure of a zebrafish P2X4 receptor the hP2X7R subunits have a large extracellular domain, two transmembrane domains and intracellularly located N- and C-termini. The second transmembrane domain (TM2) has been shown to be involved in the ion permeation and the pore opening of P2X receptor channels. For investigating the function of TM2, a biochemical and functional cysteine scanning mutagenesis study was performed using whole cell voltage clamp with application of methanethiosulfonates (MTS) covalently modifying single cysteine residues substituted into the TM2. Xenopus laevis oocytes were injected with cRNAs for the various hP2X7R constructs and ATP-dependent currents were measured. Using different MTS substances, the selectivity filter was found to be located Cterminal to S342. Application of MTSEA+ without ATP indicated that the gate region responsible for channel opening and closing is located C-terminal to S339.