Untersuchungen zur Bildung von Isoaspartat am Peptid-N-Terminus sowie zur Reparatur durch die Protein-L-isoaspartyl-O-methyltransferase

Abstract

Alzheimer und andere altersbedingte Erkrankungen gewinnen immer mehr an Bedeutung bei der Entwicklung von neuen Medikamenten. Heutzutage werden die Menschen immer älter, wodurch diese Krankheiten zunehmend auftreten und öfter beobachtet werden können als in der Vergangenheit. Diese Dissertation befasst sich mit der Untersuchung der posttranslationalen Modifikation Isoaspartat (isoAsp), dessen Reparatursystem Protein-L-isoaspartyl-O-methyltransferase (PIMT) sowie ihre Bedeutung in der Alzheimerschen Erkrankung. Mit Hilfe der Kapillarelektrophorese (CE) konnten N-terminalisomerisierte Modellpeptide getrennt werden. Dabei konnten wir als Erste die spontane isoAsp-Bildung aus Asp und Asn beobachten. Als zweites wurde ein fluoreszenz-basierter PIMT-Aktivitätsassay entwickelt, der das reparierte Peptidprodukt nachweist. Der neue Assay wurde durch CE- und HPLC-Methoden validiert und benutzt, um weitere biochemische Parameter der PIMT-Reaktion zu bestimmen (KM, IC50, pH- & T-Optimum).

Alzheimer’s disease and other age-related diseases are an increasing field of interest for drug development. Now adays people are becoming really old and those diseases are more observable than in the past. This PhD thesis is investigating the posttranslation a modification isoaspartate (isoAsp) and it’s repair system Protein L-isoaspartylO-Methyltransferase (PIMT) and it’s possible role in Alzheimer’s disease. Within this thesis capillary electrophoresis (CE) was applied to separate N-terminal isomerized model peptides, there by showing spontanous isomerisation of Asp and Asn is possible for the first time, validated via 1H-NMR. Secondly a new fluorescence-based PIMT activity assay was developed, detecting repaired peptide-product for the first time as well. The new assay was validated by CE and HPLC methods. Furthermore biochemical parameters for PIMT activity were determined using the new assay, just as pH dependence, temperature optimum and IC50for SAH.