Etablierung des Phage Display-Verfahrens für die Optimierung der Trypsiligase

Abstract

Im Rahmen dieser Dissertation wird das Phage Display-Verfahren als in vitro Selektionsverfahren für die Optimierung der bereits entwickelten Trypsiligase etabliert, die unter anderem für die regiospezifische Modifizierung von Antikörper-Wirkstoff-Konjugaten eingesetzt wird. Gegensätzlich zu der konventionellen Anwendung dieser evolutiven Technologie – typischerweise der Optimierung des Bindungsverhaltens von Enzymen und Proteinen – wurde der Fokus hier auf eine Reduzierung der nativen Sekundärhydrolyseaktivität des Biokatalysators gelegt, die eine Verschlechterung der synthetischen Eigenschaften des Biokatalysators hervorruft. Zu diesem Zweck wurde eine innovative Selektionsmethode entwickelt und etabliert, die auf dem Katalysemechanismus der Trypsiligase basiert und die das kovalente Acyl-Enzym-Intermediat als Selektionsstruktur im Selektionsprozess einsetzt. Die generelle Funktionalität der Selektionsmethode wurde im Rahmen dieser Dissertation bestätigt.

This study establishes the Phage Display technology as suitable in vitro selection system for directed optimization of the previously designed trypsiligase used for the site-specific synthesis of Antibody-Drug-Conjugates. In contrast to the conventional application of this evolutionary technology – to improve typically the binding behaviour of enzymes or proteins – here focus was exclusively laid on the systematic reduction of the biocatalyst’s native secondary hydrolysis activity impairing the synthetic properties of the designed enzyme. For this purpose, an original selection approach based on the catalytic mechanism of trypsiligase was established using the covalent acyl-enzyme-intermediate as novel pivot for the selection process. The general function of the approach was successfully validated by this study.