Vergleichende Untersuchungen über die Aktivierng von isoliertem Calpain und einer calciumabhängigen cytosolischen Protease in Linsenepithelzellen

Abstract

Ziel der Untersuchungen war es, die Wirkung der Proteinase Calpain (EC 3.4.22.17) in Zellen besser zu verstehen. Den medizinischen Hintergrund bilden dabei beschriebene Zellschädigungen bei vermuteten Disregulationen und speziell ein möglicher Zusammenhang von Calpain und Cataracten der Augenlinse (siehe S. 4). Calpain (m-Calpain), Calpastatin und Proteasomen wurden dazu aus Rinderherz isoliert. Boc-Leu-Met-7-Amino-4-Methylcumarin (Boc-Leu-Met-AMC), ein geeignetes Peptidsubstrat, wurde synthetisiert und es wurden für die immuncytochemische Untersuchung monoklonale und polyklonale anti-m-Calpain-Antiseren gewonnen. Das aus Rinderherz isolierte m-Calpain wurde charakterisiert. Es war ohne Calciumionen nicht aktiv und voll aktiv ab ca. 1mM Ca2+. Weiterhin benötigte es für die enzymatische Aktivität SH-Gruppen-reduzierendes Thiol (Mercaptoethanol). Mit Calpaininhibitoren wurde es inhibiert. In der SDS-Elektrophorese konnte m-Calpain in zwei Untereinheiten von ca. 30kD und 80kD getrennt werden und war im Zymogramm nach Ca2+-Zufuhr aktiv. Es wurde im Westernblot dargestellt. Vergleichende Untersuchungen mit Proteasomen in vitro ergaben, daß diese Proteasen Boc-Leu-Met-AMC im Gegensatz zu m-Calpain zwischen 0mM und 5mM Ca2+ unabhängig von der Calciumkonzentration hydrolysierten. Dies war für die folgenden in vivo-Untersuchungen sehr wichtig, da in Linsenepithelzellen das Peptidsubstrat sehr wohl calciumabhängig hydrolysiert wurde und somit der Einfluß von Proteasomen vernachlässigt werden konnte. Die ultramikroskopische Darstellung von m-Calpain im Rasterkraftmikroskop brachte eine übereinstimmung mit einem Molekülmodell von MURACHI (26). Es waren deutlich Abschnitte oder Domänen zu erkennen. Unter geeigneten Bedingungen organisierte sich m-Calpain auf der Oberfläche der Siliciumobjektträger zu fädigen Strukturen. In Augenlinsen finden Yoshida et al. m-Calpain (180). Somit ist es uns möglich, Befunde aus unseren Versuchen mit m-Calpain aus Herzhomogenat mit denen von Linsenepithelzellen zu vergleichen. Das Calpain-Antigen aus homogenisierten und fraktionierten Linsenepithelzellen hatte im Westernblot ein vergleichbar niedriges Molekulargewicht von weniger als 70kD. Ein ähnlich leichtes Molekül wurde auch im Westernblot von Herzhomogenat neben der 80K- und 30K-Untereinheit des Calpain nachgewiesen. In Linsenepithelzellen wurden die eingesetzten Peptidsubstrate unterschiedlich hydrolysiert: Boc-geschützte Peptide wurden spontan und hinreichend für den quantitativen Nachweis mit Hilfe der HPLC hydrolysiert. Succinylierte Derivate wurden dagegen nicht nachweisbar umgesetzt, sie sind offensichtlich nicht membranpermeabel. Daraus konnte das Fehlen einer Ektoproteasewirkung durch Calpain geschlußfolgert werden. Calpain-Inhibitoren hemmten vergleichbar zu in vitro-Versuchen, mit der Ausnahme von E-64, welches offensichtlich nicht membranpermeabel ist. Damit ergab sich ein weiterer Hinweis auf das Fehlen einer Ektoprotease mit Calpainwirkung. Eine wichtige Voraussetzung für die Untersuchungen mit unterschiedlichen Calciumkonzentrationen in Linsenepithelzellen war der Nachweis, daß deren Calciumhaushalt gezielt mit dem Ionophor Ionomycin beeinflußt werden konnte. Es wurde gezeigt, daß der Umsatz von Boc-Leu-Met-AMC calciumabhängig war. Allerdings war er bei niedrigen Calciumkonzentrationen im Cytosol hoch und wurde bei 2mM Ca2+ inhibiert ! Diese Tatsache führte zu dem Schluß, das wir es hier auch mit einer noch nicht beschriebenen, durch Ca2+ hemmbaren Protease zu tun haben könnten. Alle folgenden Versuche orientierten aber weiter auf Calpain. Der immuncytochemische Nachweis erbrachte keine diffuse Verteilung von Calpain. Es wurden fädige Strukturen gefunden, die beim Vergleich mit dem Cytoskelett übereinstimmungen brachten. Auch immunologisch wurde nach-gewiesen, daß kein Calpain auf der Oberfläche von Linsenepithelzellen existierte. Nach dem Versuch, Calpain aus Linsenepithelzellen mit Triton-X-100 in Hepes-Puffer zu extrahieren, war keine Veränderung der Antigenität gegen Calpain festzustellen. Dies deutete auf eine Verankerung des Enzyms in der Zelle bzw. auf die Unfähigkeit des Detergenz, es zu lösen hin. Linsenepithelzellen wurden bei hoher mikroskopischer Auflösung mit den Peptidsubstraten Boc-Leu-Met-AMC oder Boc-Leu-Met-CAMC inkubiert. Dabei wurde keine diffuse, sondern eine strukturierte Fluoreszenz gefunden. Kerne erschienen dunkel, wurden von einem sehr hellen Saum umgeben. Die Fluoreszenz wurde als Reihen von Punkten und unterbrochenen Linien sichtbar. Das Ergebnis war vergleichbar mit denen von immuncytochemischen Untersuchungen, wo ebenfalls eine diffuse Fluoreszenz erwartet und Filamentgebilde gefunden wurden. Es ergaben sich ähnlichkeiten der Bilder, jedoch keine Identität zwischen der Darstellung des Calpain-Antigens und den Orten proteolytischer Aktivität. Sofern diese Aktivität von Calpain ausgeht, kann man annehmen, daß die Gesamtkonzentration des Enzymproteins von der Konzentration an aktivem Enzym abweicht. Es wurde gezeigt, daß derzeitige Vorstellungen über Lokalisation und Aktivierung von Calpain möglicherweise überprüft werden müssen. Dabei ist die Tatsache einer Hemmung der Proteolyse bei hoher Calciumionenkonzentration in der Zelle besonders interessant. Bisher wurde von einer Aktivierung des Calpain bei einer Erhöhung der cytosolischen Calciumionenkonzentration ausgegangen. überein-stimmungen der immuncytochemischen Darstellung von Calpain mit dem Cytoskelett legen nahe, daß Calpain einen Haftmechanismus besitzen muß, der es dem Enzym gestattet, sich am Cytoskelett zu verankern. Auf der einen Seite werden in neueren Arbeiten Cytoskelettelemente als Calciumstores beschrieben, was gleichbedeutend mit einer inhomogenen Verteilung von Calcium im Cytosol ist, und auf der anderen Seite sind vermutlich die im Molekül vorhandenen EF-hand-Strukturen als Anker anzusehen. Sie verfügen über eine hohe Bindungsaffinität zu Ca2+ und sind in einer Vielzahl untersuchter calciumbindender Proteine enthalten. Die dominierende negative Ladung der EF-hands in beiden Calpainuntereinheiten CL und CS dokumentiert sich auch in den Bindungseigenschaften und im Elutionsverhalten an DEAE-Ionenaustauscher. Es ist ein Hinweis auf vergleichbare isoelektrische Eigenschaften. Methodisch gestattet uns die Verwendung von diffusiblen fluorogenen Peptidsubstraten mit gleichfalls diffusiblem Fluorophor sehr einfach, den hydrolytischen Umsatz der Zellen mit Hilfe einer HPLC reproduzierbar zu quantifizieren. Weiterhin wurden erfolgreich bei hoher lichtmikroskopischer Auflösung in lebenden Zellen Orte proteolytischer Aktivität nachgewiesen. Hier ergeben sich Möglichkeiten, weitere Untersuchungen anzuschließen, welche die Inhibition der Proteolyse bei hoher Ca2+-Konzentration und entgegengesetzt eine mögliche Aktivierung von Calpain betreffen, und die einen Einfluß der Protease auf das Cytoskelett beinhalten. Besonders interessant sind meiner Meinung nach Fragestellungen, die sich auf den Zusammenhang von Calpainaktivität und cytosolisch niedriger Ca2+-Konzentration beziehen. Außerdem ist sehr interessant, warum ein offensichtlich aktives Calpain, welches spontan Peptidsubstrate hydrolysiert, nicht konsequent seine endogenen Substrate, z.B. Teile des Cytoskelettes minimiert. Weiterhin gestaltet sich die Differenzierung zwischen Calpain und Aktivitäten anderer Proteasen im Cytosol recht schwierig, wie unsere Ihibitionsversuche (Calpain und Proteasomen) gezeigt haben. Zahlreiche in der Literatur beschriebene Wirkungen des Calpain sind wahrscheinlich nicht ausschließlich auf diese Protease zurückzuführen.

Our aim was to understand better how the proteinase Calpain (EC 3.4.22.17) acts in cells. The medical background is found in cell damage after disregulation probably and especially connected with Calpain and the development of cataracts of eye lens (see p. 4). Calpain (m-Calpain), Calpastatin and Proteasomes had been isolated from bovine heart muscle. A suitable peptide substrate Boc-Leu-Met-7-Amino-4-Methylcumarin (Boc-Leu-Met-AMC) had been synthesized. To investigate in immunocytochemistry we harvested monoclonal and polyclonal antisera against m-Calpain. m-Calpain from bovine heart muscle was characterized as follows: Without any Calcium ions there was no detectable proteolytic activity to be found and there was full activity with 1mM or more Calcium ions. There was also a need of SH-group reducing thiol (Mercaptoethanol). Inhibitors of Calpain inhibited the enzyme. Calpain was divided into two subunits of probable 30kD and 80kD in SDS gelelectrophoresis and we detected the enzymatic activity in zymograms after Ca2+ supplying. We also found m-Calpain in Westernblot with the help of polyclonal and less with monoclonal antisera. Investigations to compare Calpain and Proteasomes shown in vitro that in the presence of 0mM to 5mM Ca2+ Proteasomes hydrolyzed the substrate Boc-Leu-Met-AMC independently of Calcium ion concentration. This issue was very important because our investigations in bovine lens epithelium cells resulted in a strong dependence of hydrolytic activity against the substrate on the concentration of Ca2+. It was possible to demonstrate, there was no or no important influence of the Proteasomes in proteolysis of the substrate. With the help of an atomic force microscope we examined the m-Calpain ultramicroscopic structure. Here we found good correspondence in a model of the molecule of Murachi (26). It was possible to distinguish between parts or domains. Calpain was organizing itself to filaments when it was incubated under suitable conditions on high purity silica slices. Yoshida et al. detected m-Calpain in eye lens (180). So it was possible to compare results of investigations of isolated m-Calpain with those of lens epithelium cells. The Calpain antigen of homogenized and fractionated lens epithelium cells in Westernblot had a lower MW of less than 70kD compared to m-Calpain of the heart. A similar molecule later was found also in Westernblot of Calpain of the heart in addition to the 80K and the 30K subunit. We fed the lens epithelium cells with different peptide substrates and got different results: Peptides with Boc protection had been hydrolyzed spontaneously as much as necessary for good quantitative evidence in HPLC. Succinylized derivatives in contrary had not been hydrolyzed in detectable amounts. This means they where apparently not diffusable through the cell membrane, because in vitro Suc-Leu-Leu-Val-Tyr-AMC is a well known good substrate for Calpain and also Proteasomes. So we also concluded that there is no ectoprotease like Calpain. Different inhibitors of Calpain in comparison to in vitro investigations inhibited the hydrolysis in the cells except of E-64, which is known as not membrane permeable. This was another indication for a missing ectoprotease like Calpain. An important condition to investigate lens epithelium cells with different concentrations of Calcium ions was the evidence to be able to influence the concentration of Ca2+ in the cytosol with the help of Ionomycin. It was shown that the hydrolysis of Boc-Leu-Met-AMC was related to Ca2+. However we found high activities at low Calcium concentration and an inhibition at 2mM Ca2+! So we concluded there is also a possibility for a new Ca2+ inhibited protease. But in the following time we orientated first of all to Calpain. Our results in immunocytochemistry indicated no diffuse distribution of Calpain in lens epithelium cells. We found structures like filaments with conformities to the cytoskeleton. And simultaneously we also had been able to show that there is no Calpain antigen on the surface of the cells. We tryed to extract Calpain with Triton X-100 from lens epithelium cells. But we did not found any difference in immunocytochemical staining compared with controls without detergent. So it seems the enzyme was anchored within the cell or the detergent was not able to extract and remove the protein. Lens epithelium cells were incubated with Boc-Leu-Met-AMC or Boc-Leu-Met-CAMC to investigate in a Zeiss laser scanning microscope under high resolution. There was no diffuse but a structured fluorescence displayed. The spared nuclei were surrounded by a bright shining fluorescence which diminished peripher. There were shown fluorescent points and short lines which seemed to be directed from nucleus to the periphery. This result was similar to the results of immunocytochemical investigations. Here we searched for diffuse fluorescence and found structures like filaments. The photographs had been similar but not identical. If the proteolytic activity against the peptide substrate is derived from Calpain it seems the number of Calpain protein is quite different from the active enzyme. Our results suggest that the present image of localization and activation of Calpain should probably be checked up. It is very interesting that the proteolysis in lens epithelium cells is inhibited with a high concentration of Calcium ions. Up to this time it was indisputable that Calpain activation is raised with the raise of cytosolic Calcium ion concentration. Conformities of the immunocytochemical pictures of Calpain and the cytoskeleton suggest a adhesive mechanism of Calpain. So the molecule has the possibility to anchor on the cytoskeleton. On the one hand it was shown in some new papers that the cytoskeleton works as a Calcium store, which also means an inhomogeneous distribution of Calcium in the cytosol. On the other hand we assume that EF-hand structures are anchors. They have got a high affinity to bind Calcium ions and they are found in a lot of Calcium binding proteins. The dominant negative charge of the EF-hands in the two native subunits CL and CS seems also to be responsible for the binding conditions on DEAE ion-exchange material. There is an indication of likely the same isoelectric conditions. The application of diffusable fluorogenic peptide substrates which release diffusable fluorophores generates a very simple method to quantify reproducibly the hydrolytic turnover in cells with the help of HPLC. Further more it was successful shown in high magnification of light microscopy the localization of the proteolytic activity in living cells. There is the need and the possibility for following investigations with the aim to show relations between high and low Calcium concentration and activating or inhibitory effects on Calpain and also to show the influence of the protease on the cytoskeleton. Very interesting in my mind is the question of the relation between activity of Calpain and the very low cytosolic Calcium concentration. Also interesting is the paradox of an apparently active Calpain, which spontaneously hydrolyses peptide substrates but not hydrolyses and minimizes his endogenously substrates, for example parts of the cytoskeleton. Another fact is that till today there are difficulties in differentiation between Calpain and activities of other proteases in the cytosol as we showed in the investigation with inhibitors (Calpain against Proteasomes). A lot of activities of Calpain which had been shown in a number of papers probably do not derive from this only one proteinase.