Funktionelle Charakterisierung von Peptid- und Aminosäuretransportern in Leguminosen und Gerste in Relation zur Proteinakkumulation im Samen

Abstract

Der Samenproteingehalt ist ein wichtiges Ertrags- und Qualitätsmerkmal von Kulturpflanzen, und er ist abhängig vom verfügbaren Stickstoff in den Pflanzen. Aminosäure- und Peptidtransporter spielen bei der Remobilisierung und Translokation von N-Metaboliten innerhalb der Pflanze eine Rolle. Die Charakterisierung von N-Transportern in den Kulturpflanzen Leguminosen und Gerste soll helfen diese Transportprozesse besser zu verstehen. Der Peptidtransporter VfPTR1 und die Aminosäurepermease VfAAP1 wurden im Rahmen dieser Arbeit funktionell charakterisiert. Weiterhin sollten Aminosäuretransporter aus Gerste identifiziert und charakterisiert werden. VfPTR1-Aktivität konnte in Wurzeln, Spross und sich entwickelnden Kotyledonen nachgewiesen werden. Die Immunogoldmarkierung mit einem anti-VfPTR1 Antikörper gibt Hinweise auf eine Lokalisierung des Proteins in der Plasmamembran, eine Lokalisierung in der Vakuolenmembran kann aber nicht ausgeschlossen werden. Die phloemspezifische Expression von VfPTR1 (sucPTR) und VfAAP1 (sucAAP) in Erbse führt zu einer moderaten Erhöhung des Speicherproteingehaltes in den reifen Samen. Die Kreuzung von sucAAP Erbsen mit einer Erbsenlinie, die VfAAP1 samenspezifisch exprimiert, führt zu einer Erhöhung des N- und Proteingehaltes in reifen Samen im Vergleich zum Wildtyp und der Elternlinie sucAAP. Aus einer Gersten-EST-Kollektion wurden acht putative Aminosäurepermeasen (AAPFamilie) identifiziert. HvAAP1 wird am stärksten in frühen maternalen Samenteilen sowie in ährennahen Organen zum Zeitpunkt der Samenfüllung exprimiert. Das Expressionsmuster korreliert mit dem einer seneszenzspezifischen Cysteinproteinase aus Gerste. HvAAP2-mRNA konnte nur im Knoten und in Wurzeln nachgewiesen werden. Die Funktionalität von HvAAP1 und HvAAP2 wurde durch funktionelle Komplementation einer Hefemutante gezeigt. Eine intrazelluläre Lokalisierung gelang nur für HvAAP1, das GFP-Fusionsprotein wurde hauptsächlich an der Plasmamembran lokalisiert. Neben den Aminosäurepermeasen konnte aus der Gersten-EST-Kollektion noch eine putative GABA-Permease (APC-Familie) identifiziert werden.

Seed protein content is an important trait of yield and quality of crop plants and it depends on the available nitrogen in the plant. Amino acid and peptide transporters play a role in remobilization and translocation of N-metabolites within the plant. The characterization of N-transporters in the crop plants legumes and barley shall help to understand such transport processes better. The peptide transporter VfPTR1 and the amino acid permease VfAAP1 were functional characterized in frame of this work. Moreover, amino acid transporters from barley should be identified and characterized. VfPTR1 activity was detected in roots, stem and developing cotyledons. An immuno gold labeling with an anti-VfPTR1 antibody gives evidence for localization in the plasma membrane but localization in the vacuolar membrane cannot be excluded. Phloem specific expression of VfPTR1 (sucPTR) and VfAAP1 (sucAAP) in pea leads to an increased storage protein content in mature seeds. The crossing of sucAAP pea plants with a pea line which expresses VfAAP1 seed specific, leads to an increase in N and protein content in mature seeds in comparison to wildtype plants and the parental line sucAAP. From a barley EST collection eight putative amino acid permeases (AAP family) were identified. HvAAP1 is expressed strongest in early maternal seed parts as well as in ear near organs at the time of seed filling. The expression pattern correlates with that of a senescence specific cysteine proteinase from barley. HvAAP2-mRNA could only be detected in nodes and roots. The functionality of HvAAP1 and HvAAP2 was shown by complementation of a yeast mutant. An intracellular localization was only successful for HvAAP1, the GFP fusion protein was localized mainly at the plasma membrane. Besides the amino acid permeases a putative GABA permease (APC family) could be identified from the barley EST collection.