Biochemie und Protein-Protein Wechselwirkungen des humanen FK506-bindenden Proteins 36

Abstract

Für den Ablauf der Spermatogenese von Nagetieren ist das FK506 bindende Protein 36 (FKBP36) ein unerlässlicher Faktor. Der Verlust dieses FKBP führt in männlichen Tieren zum Abbruch der Meiose im Pachytän-Stadium woraus Infertilität resultiert. FKBP36 gehört zur Gruppe der FKBP mit TPR-Motiv. Diese Mehrdomänenproteine sind am Aufbau und der Regulation von Multiproteinkomplexen beteiligt. Um die bislang zu diesem Protein durchgeführten gentischen- und immunohistochemischen Untersuchungen zu ergänzen, wurde das Protein FKBP36 eingehend biochemisch charakterisiert. Für die Charakterisierung wurden unterschiedliche Abschnitte der für das humane FKBP36 kodierenden cDNA in Expressionsvektoren kloniert und die entsprechenden Proteine gereinigt. Sekundärstrukturelemente der gereinigten Proteine wurden mittels CDSpektroskopie untersucht. Aufgrund der Sequenzhomologie zur Enzymklasse der PPIasen wurden unterschiedliche FKBP36-Varianten auf PPIase-Aktivität untersucht. Für das Wildtyp Protein konnte mit den etablierten Tests keine katalytische Aktivität bestimmt werden. Auf Grundlage von Strukturmodellen wurde eine Proteinvariante FKBP36 R81L erzeugt, welche eine charakteristische PPIase-Aktivität aufweist. Mit Hilfe von co-Präzipitationsexperimenten wurden Hsp90, Hsp72, die schwere Kette von Clathrin und GAPDH als spezifische Interaktionspartner des FKBP36 identifiziert. Die unterschiedlichen Interaktionen konnten auf verschiedene definierte Bereiche des FKBP eingegrenzt werden und sind auf bestimmte subzellulare Kompartimente beschränkt. Daraus lässt sich die Beteiligung von FKBP36 an unterschiedlichen Multiprotein-Komplexen und damit eine Multifunktionalität ableiten. Wahrscheinlich istFKBP36durch Bindung und Inhibition von GAPDH sowohl an der Regulation des Stoffwechsels als auch über die Interaktion mit dem Spermatogenese relevanten Hsp72 an der Regulation der Signaltransduktion der Meiose beteiligt.

FKBP36 has been previously shown to be a crucial factor in spermatogenesis. Loss of FKBP36 disrupts meioses in pachyten causing infertility in male rodents. FKBP36 belongs to the group of TPR-motif containing FKBPs known to be involved in assembly and regulation of multi-enzyme-complexes. In order to supplement the genetically and immunohistochemically investigations the FKBP36 protein was characterized extensively by biochemical methods. Several parts of the human FKBP36 cDNA were cloned into expression vectors. After expression, the corresponding proteins were purified and investigated. Existence of secondary structure elements was revealed by CD-spectroscopy. Although the protein shows homology to FKBP, it could be shown that the wildtype FKBP exhibits no PPIase activity in the established assays. By means of structural modeling a protein variant FKBP36 R811L was designed, showing characteristic PPIase activity. Additionally, Hsp90, Hsp72, Clathrin heavy chain and GAPDH have been identified as specific interaction partners of FKBP36 by a co-precipitation assay. Interaction sites were shown to be localized on different protein regions and interactions occur restricted within distinct subcellular compartments. FKBP36 participates in different multi-protein-complexes and may be multifunctional. By binding and inhibition of GAPDH it possibly regulates cellular metabolism and by interaction with HSP72 it belongs to the essential components of meiotic signal transduction.