Herstellung von Spinnenseidenproteinen in Tabaksamen

Abstract

Spinnenseide ist ein vielseitiges und hochqualitatives Material, das für verschiedene technische Anwendungen interessant ist, so zum Beispiel in der Medizin, den Ingenieurswissenschaften und der Zellkulturtechnik. Eine Herausforderung auf dem Weg zur technischen Nutzung von Spinnenseidenproteinen ist deren kostengünstige Produktion in großen Mengen. Bereits im Labormaßstab werden mehrere Gramm gereinigtes Spinnenseidenprotein benötigt, um eine möglichst vollständige mechanische Testung zu ermöglichen. Im Rahmen dieser Arbeit wurden verschiedene Spinnenseidenkonstrukte in Samen von Nicotiana tabacum exprimiert und das Samensystem mit der Expression im Blatt hinsichtlich der produzierbaren Mengen an transgenem Protein verglichen. Weiterhin wurde die Langzeitstabilität der Proteine im Samen bei Raumtemperatur über einen Zeitraum von einem Jahr untersucht, um die Samenexpression als unkompliziertes Produktionssystem für den Laborbedarf zu etablieren. Die Reinigung des transgenen Proteins wurde mittels der etablierten Inverse Transition Cycling-Methode durchgeführt, die allerdings für das neue Expressionssystem Tabaksamen erweitert und optimiert werden musste. Um eine Verbesserung der Materialeigenschaften zu erreichen oder eine etwaige spätere Fasergewinnung der Spinnenseidenproteine zu ermöglichen, ist es wünschenswert, die Größe der transgenen Proteine weiter zu erhöhen. Dazu wurden verschiedene Spinnenseidenkonstrukte mit Dimerisierungsmarken versehen und in Tabak exprimiert. Anschließend konnte die posttranslationale Verknüpfung mittels bakterieller Transglutaminase durchgeführt werden.

Spider silk is a versatile and high quality material, which is interesting for many different technical applications, for example in medicine, engineering and cell culture technology. A challenge on the way to the technical utilization of spider silk proteins is the cost-effective production in great quantities. Already at the lab scale, more than a gram of purified spider silk protein is necessary to enable a sufficient mechanical testing. In the frame of this work, different spider silk constructs were expressed in seeds of Nicothiana tabacum and the seed system was compared to the expression in leaves regarding the producible amount of transgenic protein. Furthermore, the longterm storage stability of spider silk proteins in seeds was checked at room temperature over a period of twelve months to establish the seed production as an uncomplicated production system for lab scale demands. The purification of the transgenic protein was done using the established inverse transition cycling method, which was expanded and optimized according to the new expression system in tobacco seeds. To achieve better material properties or to enable a future construction of fibers from spider silk proteins, it is desirable to further increase the size of the transgenic proteins. For this reason, dimerization tags were attached to different spider silk constructs and expressed in tobacco. This was followed by the posttranslational conjunction via bacterial transglutaminase.