A proteomic approach to investigate agronomic traits in barley using the genetic variation of mapping populations

Abstract

Die Verfügbarkeit vollständig sequenzierter Genome von Modell- und Nutzpflanzen, sowie die große Anzahl expressed sequence tags (EST) führte in den letzten Jahren zur Entwicklung neuer methodischer Ansätze. Das Ziel der "Funktionellen Genomik" ist die Aufklärung der Funktion einer Vielzahl von Genen in globalen Transkript- und Proteinstudien, in denen u.a. mutagenisierte oder transgene Pflanzen untersucht werden. Die Expression von Genen und Proteinen kann aber auch als quantitatives Merkmal allelischer Diversität genutzt werden. Das Konzept der "Genetische Genomik" zielt auf die Lokalisierung eines bestimmten Gens im Genom hin, indem Expressionsuntersuchungen einzelner Individuen einer segregierenden Population mit der Analyse der Genomstruktur mittels molekularer Marker verknüpft werden. In dieser Dissertation wurden beide Methodiken für die Aufklärung der Proteinzusammensetzung reifer Samen und die Untersuchung von Salzstressmechanismen in Gerste verwendet. Gerste (Hordeum vulgare) ist eine wichtige Getreidepflanze, die für die Futtermittel- und Brauindustrie angebaut wird. Wegen dieser landwirtschaftlichen Bedeutung besteht ein hohes Interesse, die molekularen Faktoren für den Nährstoffgehalt und die abiotische Stresstoleranz des Gerstenkorns zu bestimmen. Reife Körner von Introgressionslinien, die aus der Kreuzung der Züchtungssorte "Brenda" mit der Linie HS213 einer Wildgerste (Hordeum spontaneum) entstanden sind, wurden mittels zweidimensionaler Gelelektrophorese auf den Gehalt und die Zusammensetzung der wasserlöslichen Proteinfraktion untersucht. In zwei unabhängigen Ernten wurden ungefähr 70 QTL für die Proteinexpression detektiert und massenspektrometrisch identifiziert. Obwohl nur eine begrenzte Anzahl an QTL in beiden biologischen Experimenten reproduziert werden konnten, weisen die Resultate auf eine hohe technische Reproduzierbarkeit der Gelelektrophorese hin. Im Vergleich zu anderen Getreidepflanzen zeichnet sich Gerste als besonders salztolerant aus, wobei unter der Vielzahl von Varietäten und Sorten eine hohe Variabilität gegenüber Salzstress besteht. Um die Faktoren auf molekularer Ebene zu ermitteln, die für Salztoleranz während der Keimung und in späteren Entwicklungsstadien eine Rolle spielen, wurden vergleichende Proteomanalysen von salztoleranten und salzsensitiven Akzessionen der Oregon Wolfe Barley und der Steptoe Morex Kartierungspopulation durchgeführt. In reifen Körnern und in Wurzeln konnten Proteine detektiert werden, die eine gegensätzliche Expression in toleranten und sensitiven Linien aufwiesen. In toleranten Akzessionen waren u.a. solche Proteine höher abundant, die eine Rolle in der Bildung von NADPH und in der Synthese von ABA-responsiven Proteinen haben. Um die Funktionalität der identifizierten Proteine zu testen, wurden Überexpressionsstudien mit konstitutiven und Endospermspezifischen Promotoren in der Gerstensorte "Golden Promise" initiiert.

In recent years, the complete genome sequences of model (Arabidopsis thaliana) and crop plants (Oryza sativa) as well as an enormous number of plant expressed sequence tags (EST) have become available. This huge information resource is utilized for the determination of the function of many genes simultaneously in "Functional Genomics" approaches including global transcript and protein profiling together with the employment of mutant and transgenic plants. In order to assign the location of a gene in the genome, gene expression studies can be combined with genomic marker analysis in "Genetical Genomics" approaches. In this thesis both types of studies were applied for the determination of grain protein composition and for analysing salt stress mechanisms at the germination and at the seedling stage in barley. Barley (Hordeum vulgare) is an important cereal crop grown both for the feed and malting industries. Hence, there is a high interest to gain deeper insight into the determinants of nutritional quality and abiotic stress tolerance at the molecular level in order to improve the assessment of new traits. For the characterization of a set of doubled haploid introgression lines presenting a wild barley genome (Hordeum spontaneum HS213) within a modern cultivar background (H. vulgare cv. Brenda), 2-dimensional (D) gel electrophoresis was employed for the analysis of protein content and composition of mature grains. In two independently grown sets of plants, about 70 QTL for protein expression were detected and subjected to mass spectrometry-based identification. Although only few QTL signals could be recovered due to variances in growing conditions between both sets, results demonstrate the high technical reproducibility in detecting single features in the overall protein complement that can be achieved by 2-D gel electrophoresis. Among the cereals, barley is considered as notably salt tolerant and cultivars display considerable variability in tolerance towards salt stress. With the objective to investigate the determinants of salt tolerance during germination and at later developmental stages, the grain and root proteome of salt tolerant and salt sensitive accessions from the Oregon Wolfe Barley mapping population and the Steptoe Morex mapping population were compared. As a result, protein spots were identified differing in expression between groups of salt tolerant and salt sensitive genotypes in both populations. More abundant in salt tolerant cultivars were proteins that play a role in NADPH generation and the synthesis of ABA-responsive proteins. To test their functionality, stable transformation studies in the barley cultivar ("Golden Promise") using promoters, which drive ubiquitous and endosperm-specific expression, were initiated.