Physiological, biochemical, histological und ultrastructural aspects of cryopreservation in meristematic tissue of potato shoot tips

Abstract

Kryokonservierung ist die am besten geeignete Methode für die Langzeitlagerung von vegetativ zu erhaltenden Pflanzen wie Kartoffel. Im Leibniz-Institut für Pflanzengenetik und Kulturpflanzenforschung (IPK) wird die Kartoffel-Kryokonservierung nach einer empirisch optimierten Methode ausgeführt. Ziel der Arbeit war es, auf zellulärer Ebene Prozesse nach den einzelnen Schritten des Kryokonservierungsprotokolls zu analysieren und zu charakterisieren, um die DMSO-Tröpfchenmethode zu verbessern. Physiologische, biochemische, histologische und ultrastrukturelle Analysen wurden an Kartoffelsprosssspitzen durchgeführt. Die Sprossregeneration erhöhte sich nach einer Vorkultur der In-vitro-Ausgangspflanzen vor der Kryokonservierung von 7 Tagen mit Wechseltemperaturen bei 22/8 °C Tag/Nachttemperatur mit 8 h Lichtdauer im Vergleich zur bisher genutzten Methode. In dieser wurde eine Vorkultur für 7 Tage mit konstanten Temperaturen bei 22 °C mit 16 h Lichtdauer angewendet. Das Ausgangsmaterial wurde nach Ablauf der Vorkulturen biochemisch untersucht, um Korrelationen zu den besseren Kryokonservierungsergebnissen zu finden. Die Erhöhung der Konzentration der löslichen Zucker nach der Vorkultur mit Wechseltemperaturen korrelierte mit den verbesserten Regenerationsraten nach der Kryokonservierung. Nur geringe Veränderungen zwischen den Vorkulturen konnten für die Konzentration von Stärke, Aminosäuren, Proteinen und die Osmolalität gefunden werden. Ultrastrukturelle Untersuchungen zeigten eine Veränderung nach der 2-stündigen DMSO-Inkubation. Die Regeneration von Pflanzen aus den Sprossspitzen nach der Kryokonservierung startete meist von den jüngsten Blattprimordien und seltener direkt aus dem meristematischen Dom. Thermische Untersuchungen mittels Dynamischer Differenzkalorimetrie (DSC) zeigten, dass nach der Inkubation der Sprossspitzen in DMSO-Lösung sich eine geringe Menge an Eiskristallen während des Abkühlens bildete und diese beim Erwärmen schmolzen. Bei S. tuberosum 'Désirée' konnte neben der Eisbildung auch ein schwacher Glasübergang bei ca. -116 °C detektiert werden. Die Eignung der DMSOTröpfchenmethode ist durch die erfolgreiche Lagerung einer sehr großen Anzahl von Mustern bewiesen worden, wenngleich eine Eisbildung im Ablauf der Kryokonservierung beobachtet worden ist.

Cryopreservation is the most suitable method for long-term storage of vegetatively propagated plants like potato. In the Leibniz Institute of Plant Genetics and Crop Plant Research (IPK) cryopreservation of potato is carried out following an empirically optimised method. The aim was to analyze and characterize processes on cellular level in different steps of the cryopreservation protocol to improve the DMSO droplet method. Physiological, biochemical, histological and ultrastructural analyses were performed on potato shoot tips. Increased shoot regeneration was found after alternating temperature preculture of donor in vitro plants for 7 d at 22/8 °C day/night temperature with 8 h photoperiod compared to the original method using preculture with constant temperatures for 7 d at 22 °C with 16 h photoperiod. After preculture donor material was analyzed biochemically to find correlations to the observed better cryopreservation results. After alternating temperature preculture increase in soluble sugars can be correlated to the improvement of regeneration results. Only minor differences between precultures were found for concentrations of starch, amino acids, proteins and for osmolality. Ultrastructural investigations revealed changes on the cellular level after 2 h DMSO incubation. Regeneration of plants from shoot tips after cryopreservation started mainly in the youngest leaf primordia and seldom in the meristematic dome. Thermal analyses using differential scanning calorimetry (DSC) revealed that water crystallized during cooling and melted during warming in shoot tips after incubation in the DMSO solution. In S. tuberosum 'Désirée' additionally to ice formation very small glass transition was found at around - 116 °C. Success in the DMSO droplet cryopreservation method is evident, also with a limited ice formation in the cryopreservation process.