Testung des Einflusses unterschiedlicher pH-Bedingungen auf die DNA-Stabilität anhand von Miniorgankulturen - Etablierung eines Modells

Abstract

Einleitung: Ein Zusammenhang zwischen pharyngo-laryngealem Reflux und der Tumorentstehung im oberen Aerodigestivtrakt wird in der Literatur zwar postuliert, ein Beweis konnte bisher allerdings nicht erbracht werden. In der vorliegenden Arbeit wurde überprüft, ob Miniorgankulturen humaner nasaler Schleimhaut zur Untersuchung des Einflusses von pH-Wert-Erniedrigungen auf die DNA-Stabilität herangezogen werden können und ob pH-Wert-Absenkungen des extrazellulären Milieus Schäden an der Erbsubstanz in Form von Einzelstrangbrüchen hervorrufen können. Diese sollten mit Hilfe des Comet-Assays nachgewiesen werden. Material und Methoden: Mukosa von 18 Patienten wurde in Form von Miniorganen kultiviert und zwei verschiedenen Versuchsprotokollen unterzogen. In der ersten Versuchsreihe erfolgte eine einfache Schädigung am siebenten Kulturtag. In der zweiten wurde die Schleimhaut nach siebentägiger Kultur im Abstand von zwei Tagen (Tage 7, 9 und 11) kumulativ mit acht verschiedenen pH-Werten geschädigt. Zu jedem Experiment wurden eine Positiv- und eine Negativkontrolle mitgeführt. Die erwartete genotoxische Wirkung der sauren Lösungen wurde mittels Comet-Assay quantifiziert. Ergebnisse: Die Untersuchungen haben ein geringes genotoxisches Potential von Salzsäure unterschiedlicher Konzentrationen gegenüber menschlichen Nasenschleimhaut-epithelzellen offenbart. Die schädigende Wirkung auf das Erbgut scheint von der Protonenkonzentration weitgehend unabhängig. Diskussion: Miniorgankulturen humaner nasaler Mukosa kommen durch ihren intakten Zellverband der in vivo Situation sehr nahe. Miniorgankulturen und der Comet-Assay sind für die Untersuchung der genotoxischen Effekte auf die respiratorische Schleimhaut gut geeignet. Um das System noch effizienter zu gestalten, sollten die Miniorgankulturen hinsichtlich ihrer Spender, Gruppen mit weitgehend gleichen Eigenschaften zugeführt werden. Die Analysen sollten verblindet und immer vom selben Experimentator durchgeführt werden. Die hier etablierte Methode wird zur Evaluation des genotoxischen Potentials und der Fähigkeit zur Apoptoseinduktion weiterer, im Refluxat enthaltener Stoffe, eingesetzt.

Introduction: A correlation between laryngo-pharyngeal reflux and the development of tumours in the upper aero digestive tract is postulated in literature, but there is still no evidence. We reviewed the ability of mini-organ-cultures of human nasal mucosa to analyze the influence of a decreased pH-value on the DNA-stability and its potency to cause DNA-single-strand-breaks in the epithelial cells of the upper aero digestive tract. The DNA-strand-breaks should be detected by the comet assay. Material and methods: Turbinate mucosa from 18 patients was cultured as mini-organs. Two different experimental strategies were used. The first experimental protocol performed a single incubation at lower pH values on the seventh day of culture. The second protocol performed a cumulative impairment on three days (days 7, 9 and 11) and a two day recovery time at eight different pH-values. A positive- and a negative-control were carried out in each experiment. The expected genotoxic effect of the acidic solution was quantified by the comet-assay. Results: The incubation of turbinate mini organ cultures at lower pH values showed only a slight genotoxic effect. The genotoxic effect of reflux seems to be independent from the proton concentration. Discussion: Mini-organ-cultures of human nasal mucosa are close to the in vivo situation, because of the intact tissue formation. Mini-organ-cultures and the comet-assay are suitable tools to study the genotoxic effects on respiratory mucosa. To make this system more efficient, the mini-organ-cultures should be grouped to widely similar attributes of its donors. Analysis should be blinded and undertaken always by the same experimentator. The established method is used to evaluate the genotoxic potential of other ingredients of the refluxate and its potency to induce apoptosis.