Expression und Funktion von MRP-Proteinen als Xenobiotika-Detoxifikationssystem in humanen Lungenzellen in Kultur

Abstract

Die Inhalation stellt den wesentliche Aufnahmeweg des Körpers für gasförmige oder partikelgebundene Substanzen einschließlich Staub dar. Die Lunge ist somit hoch exponiert gegenüber Schadstoffen und benötigt so ein wirksames Abwehr-System. MRPTransportproteine stellen einen Teil dieser Abwehr dar, in dem sie zum Efflux von Schadstoffen aus der Zelle beiträgt. "Multidrug Resistance Related Proteine" (MRP), welche zur Sub-Familie C der ABC-Transporter-Superfamilie gehören, sind in der Lage, Xeno- und Endobiotika zu transportieren. Zur Untersuchung der zellulären Verteilung der MRPs dienten kultivierte Lungenzellen, normale humane brochialepithelzellen (NHBEZ) und periphere Lungenzellen (PLZ), die unter geeigneten Kulturbedingungen differenzieren. Als Modell-Kulturen dienten kultivierte Lungentumorzelllinien A549, H358 und H322, die unter geeigneten Kulturbedingungen wachsen In immunohistochemischen Analysen konnte die Expression von MRP1-5 in NHBEZ, PLZ und der Tumorzellline A549 nachgewiesen werden. Alle untersuchten MRP-Isomere (MRP1-5) wurden in der Tumorzellline A549 ausschließlich in der Zellmembran exprimiert gefunden. In den normalen humanen Bronchial- und Lungenzellen zeigte sich die Lokalisierung der untersuchten MRP- Isoformen deutlich differenzierter. So wurden MRP2, 4 und 5 intrazellulär, mit höherer Dichte in intrazellulären Membran von Vesikeln gefunden, während MRP1 und 3 ausschließlich in der Zellmembran exprimiert erschienen. Es gelang humane Lungenzellen mittels Membraninserts unter in vivo nahen Bedingungen zu kultivieren. Im Vergleich zu unter klassischen, Untertauchbedingungen kultivierten Zellen, zeigten die membrangewachsenen Zellen eine deutlich andere Morphologie. Darüber hinaus wiesen sie einen höheren epithelialen Charakter auf. Mittels Confokal-LASER-Scanning Mikroskopie konnte eine in den klassischen Untertauchkulturen nicht vorhandene polarisierte Verteilung der MRP1 und 2-Proteine in den Membran-gewachsenen Kulturen nachgewiesen werden. MRP1 war deutlich im basolateralen, dem Medium zugewandten Bereich, jedoch nicht im apikalen Bereich der Zelle exprimiert. MRP2 wurde als Membranprotein lokalisiert. Das Multidrug-Resistance-associated protein MRP-1 ist in der Lage durch einen aktiven Transport unter Hydrolyse von ATP zahlreiche Xenobiotika und intrazellulär gebildete Metabolite durch die Zellmembran in den Extrazellulärraum zu transportieren. Durch die Etablierung einer Methode zur Bestimmung der MRP-1 Transportaktivität mittels Zell- Fluorometrie für adhärent wachsende Zellen konnte gezeigt werden, dass MRP1 funktionell aktiv ist. Unter Nutzung der Einzel-zellfluorimetrie wurde mittels Carboxy-2', 7'- dichlorofluorescein (CDF) die Funktion des MRP-1 nachgewiesen. Der etablierte Inhibitor der MRP-1 Funktion MK571 führte zu einer spezifischen Hemmung des MRP-1 und damit des MRP1 abhängigen CDF Effluxes. Dabei konnte eine Beteiligung von MDR-1 am Transport von CDF mittels Co-Inkubation mit dem MDR1-spezifischen Inhibitor Verapamil ausgeschlossen werden. Die Einstellung des Gleichgewichtes in Verapamil-co-inkubierten Zellkulturen vollzog sich im gleichen Zeitraum wie in inhibitorfreien Kontroll-Kulturen und ist somit völlig unabhängig von Verapamil. Man kann somit davon ausgehen, dass ein Pgp - unabhängiger Transport von CDF durch MRP-1 vorliegt. Regulatoren des Glutathion-Pools - Buthionin Sulfoximin (BSO) und N-Acetylcystein (NAC) - beeinflussen die Aktivität des MRP-1 vermittelten Transportes deutlich. Durch Regulierung des Glutathionpegels kann diese Transportaktivität gesteuert werden und eröffnet somit die Möglichkeit der Überwindung der Resistenz in der Zelle.

The transport of molecules across membranes is an essential function of all living organisms and a large number of specific transporters have evolved to carry out this function. The largest transporter gene family is the ATP-binding cassette (ABC) transporter superfamily. The multidrug resistance associated protein (MRP) family is comprised of nine related ABC transporters. The intra-cellular distribution of the different MRP isoforms in relation to their physiological and non physiological function is still a point of discussion. For this purpose we used normal human lung cells (bronchial epithelial cells, NHBEC, and peripheral lung cells, PLC) as well as tumor cell cultures as test tools to investigate the intracelluar localisation of these proteins under classical culture conditions and under air-liquid interface by means of indirect fluorescence microscopy. Characterisation of the cultured cells as lung epithelial cells was performed by means of immunocytochemical analysis. MRP1 and 3 were localised to the cellular membrane in all tested lung cell types. In contrast to that MRP2, 4 and 5 could be described as intracellular proteins in NHBEC and PLC. All MRP1-5 isoforms could be characterized in A549 tumor cell line as membrane proteins. In order to imitate the physiological in vivo circumstances in the lung , we have established a dry/wet method (air-liquid interface) for cell cultivation so that cultured cells have the option to polarize between air and basal membrane and this might influence the distribution pattern of MRP1 and 2 in NHBEC. Using confocal laser scanning techniques we could show that in cells kept under dry/wet conditions MRP1 was found to be localised to baso-lateral cell regions while MRP2 was localised to all cell regions. Under classical culture conditions MRP1 was not localized to particular membrane regions and MRP2 was found to be an intracellular protein. MRP1 is a cellular detoxifying factor supposed to transport a wide range of compounds across cell membranes either as GSH conjugates or as co-transport accompanying glutathione transposition. In this study we have undertaken experiments on the transport activity of MRP1 in cultured human lung tumor cells in order to check whether MRP1 is expressed as a functionally active protein. For this purpose we have adapted a quantitative fluorescence imaging assay to conditions where a small number of attached cells should be repeatedly measured by a non destructive method. In cultured A549, H358 and H322 cells MRP1 is located in the cell membrane as observed by immunocytochemistry. Efflux of 5,6-carboxy-2'- 7'-dichloro-fluorescein (CDF) from lung cells was sensitive toward the MRP1 inhibitor MK571 while verapamil had no effect. On the other hand, efflux of Rhodamin 123, a Pgpglycoprotein substrate, from lung cells reacted to inhibition by verapamil, while MK571 had no effect. Modulation of glutathion (GSH) content of lung cells by N-acetyl cystein (NAC) and buthionine sulfoximine (BSO) shifted CDF efflux toward higher or lower rates respectively. These experiments confirm that MRP1 function can be followed in the attached cells in vitro under non toxic concentrations of the substrates without the need to harvest and destroy the cells.