Untersuchungen von Varianten des Polyomavirus-Hüllproteins VP1 im Hinblick auf gentherapeutische Anwendungen

Abstract

Virusanaloge Partikel stellen ein vielversprechendes alternatives Therapie-Konzept dar, bei dem alle Komponenten einzeln hergestellt und entsprechend der jeweiligen Anwendung, modular in vitro zusammengefügt werden. Ziel der vorliegenden Arbeit war es, die Möglichkeiten und Grenzen eines Therapiesystems zu evaluieren, das auf der in vitro-Assemblierung des Polyomavirus-Hüllproteins VP1 beruht. VP1 wurde rekombinant in Escherichia coli hergestellt und physikochemisch charakterisiert. Durch molekularbiologische Techniken wurden Varianten des Proteins hergestellt, die neue Funktionen besaßen. Die Eigenschaften dieser Varianten wurden proteinchemisch und in Zellkultur-Modellen analysiert. Eine Untersuchung der in vitro-Assemblierung ergab einen zweistufigen Mechanismus, bei dem zunächst ein Gleichgewicht zwischen Kapsomeren und reduzierten Kapsiden eingestellt wird. In einem zweiten Schritt wird eine intrapentamere Disulfidbrücke geschlossen, so dass die Assemblierung unter oxidierenden Bedingungen irreversibel verläuft. Neben den Cysteinen, die diese Disulfidbrücke ausbilden wurde ein weiteres Cystein in die Sequenz eingeführt (C248), das für eine thiolspezifische Markierung mit Fluoreszenzfarbstoffen verwendet wurde. Die Aufnahme der fluoreszenzmarkierten virusanalogen Partikel in eukaryontische Zellen konnte mit einem konfokalen Laser-Scanning-Mikroskop visualisiert werden. Die Partikel wurden über endozytotische Vesikel aufgenommen und dann größtenteils in zellulären Lysosomen angereichert. Zur Kopplung externer Liganden an das VP1 wurde die Sequenz einer FBP11 WW-Domäne, die spezifisch eine Klasse prolinreicher Liganden bindet, in die VP1-Sequenz inseriert. Die WW-Domäne wurde auf der Kapsidoberfläche präsentiert und erlaubte die Bindung von Proteinen und Peptiden, die eine entsprechende prolinreiche Sequenz trugen. Eine weitere VP1-Variante wurde so hergestellt, dass die WW-Domäne auf der Kapsidinnenseite präsentiert wurde. Damit war es möglich Peptide und Proteine, die das Erkennungsmotiv für die WW-Domäne trugen, in das Innere der Partikel einzuschließen. In Zellkultur-Experimenten wurde ein effizientes Delivery der eingeschlossenen Moleküle in die Zielzellen gezeigt. Experimente zur Herstellung viraler Polyomavirus-Vektoren zeigten eine starke Abhängigkeit der Titer replikationsdefizienter Polyomaviren von der Expression aller drei T-Antigene. Bei einer genomischen Integration des Gens der T-Antigene findet kaum alternatives Spleißen statt, so dass fast ausschließlich das große T-Antigen exprimiert wird. Dieses ist jedoch nicht für die Bildung infektiöser Partikel ausreichend. In dieser Arbeit wurden die grundlegenden Voraussetzungen für den Einsatz von Polyomavirus-analogen Partikeln als ein modulares Vektorsystem zum Delivery therapeutischer Substanzen geschaffen. Das Hüllprotein VP1 kann in großen Mengen und hoher Reinheit hergestellt und effizient in vitro assembliert werden. Die Kapsidaußenseite kann auf unterschiedliche Weise modifiziert werden (Sequenzinsertionen, Kopplung externer Liganden). Peptide und Proteine können in die Partikel eingeschlossen und somit in die Zielzellen transportiert werden.

Virus-like particles are a promising alternative for the delivery of therapeutic substances. They allow a modular assembly in vitro with all components that are necessary for a given application, while all components are produced independently. This thesis addresses possibilites and limits of a therapeutic system based on virus-like particles consisting of the polyomavirus major capsid protein VP1. VP1 was recombinantly expressed in Escherichia coli, purified, and physicochemically characterized. Site-directed mutagenesis was used to produce VP1 variants with novel functions. The properties of these variants were analysed on a protein level and in cell culture models. An analysis of the in vitro assembly process suggested a two-step mechanism. In a first step, an equilibrium between capsomeres and reduced capsids exists which is only dependent on the Ca2+-concentration. In a second step, an intrapentameric disulfide bridge is closed that irreversibly fixes the capsomeres within the capsid under oxidizing conditions. Besides these two essential cysteines, a new cysteine was introduced into the VP1 sequence (C248) for thiolspecific labelling of VP1 with fluorescence dyes. This approach allowed a direct visualization of fluorescent virus-like particles inside eukaryotic cells using a confocal laser-scanning microscope. Particles enter the cells via endocytotic vesicles and are mostly enriched within cellular lysosomes. For the coupling of external ligands onto virus-like particles the sequence of the FBP11 WW domain was inserted into the VP1 sequence. The FBP11 WW domain binds a specific class of proline-rich sequences. The WW domain was presented on the surface of the particles and allowed a specific coupling of peptides and proteins fused to appropriate proline-rich recognition sequences. Another variant of VP1 carried the WW domain near the N-terminal end at the inner surface of the capsid. This construct was used to encapsidate polyproline-tagged peptides and proteins during the in vitro assembly process. Cell culture studies demonstrated an efficient delivery of the encapsidated molecules into the target cells. Experiments for the production of viral polyomavirus vectors showed that the titer of replication-deficient viral particles depends on the presence of all three T-antigens. An integration of the gene that encodes the T-antigens into chromosomal DNA resulted in a loss of correct alternative splicing. Only large T-antigen was expressed in the packaging cell lines which is however, insufficient for the formation of infectious particles. In summary, this thesis describes essential prerequisites for the use of polyomavirus-like particles as a modular vector system for the delivery of therapeutic substances. The capsid protein VP1 can be easily produced with high purity. The well-characterized in vitro assembly into virus-like particles is highly efficient. It is possible to modify the outer surface in different ways (sequence insertions, coupling of external ligands). Peptides and proteins can be encapsidated into the protein and are efficiently delivered into the target cells.