Kalziumwellen in Agarose-Gel mit resuspendierten Vesikeln des sarkoplasmatischen Retikulums - Einfluss der Vesikeldichte auf die Ausbreitungsgeschwindigkeit

Abstract

Kalzium nimmt eine zentrale Stellung innerhalb zellulärer Signalkaskaden ein. Ähnlich anderen Signal-Ionen und -Molekülen geht eine Erhöhung der zytosolischen Konzentration im Allgemeinen mit einer Aktivierung von spezifischen Zellfunktionen einher. Für die Ausbreitung von Kalziumsignalen spielt die kalziuminduzierte Kalziumfreisetzung aus den Membranen des sarkoplasmatischen Retikulums (SR) eine wichtige Rolle. Vesikel des SR sind an der Entstehung von elementaren Ereignissen wie Kalziumsparks, Kalziumoszillationen und Kalziumwellen beteiligt. Den Hintergrund dieser Arbeit bilden frühere Erkenntnisse, wonach sich Cluster von kalziumbeladenen SR-Vesikeln in einem Agarose-Gel wie ein erregbares Medium verhalten, in dem sich räumlich-zeitliche Kalziummuster ausbreiten. In einer dreidimensionalen, hexagonalen Anordnung ist der Abstand benachbarter kugelförmiger Objekte konstant. Auch SR-Vesikel können als solche Objekte angesehen werden und es wurde erwartet, dass es eine nichtlineare Beziehung zwischen dem Abstand der Cluster zueinander und der Proteinkonzentration gibt. Zur Klärung dieser Fragestellung wurden Agarose-Gele mit eingebetteten SR-Vesikeln zum Erstarren gebracht und fixiert. Elektronenmikroskopische Untersuchungen brachten jedoch keine Bestätigung der erwarteten Beziehung zwischen dem mittleren SR-Vesikelabstand und der vesikulären Proteinkonzentration. Im Gegensatz dazu zeigte sich lichtmikroskopisch eine proteinkonzentrationsabhängige Anordnung von SR-Vesikelclustern, die durch eine lineare Funktion beschrieben werden kann. Stabile Kalziumwellen traten bei SR-Proteinkonzentrationen zwischen 7 und 16,32 mg/ml auf. Die Geschwindigkeit der Wellenausbreitung zeigte ein Optimum bei etwa 12 mg/ml und erreichte Werte von bis zu 60 µm/s. Der entsprechende Abstand zwischen benachbarten Kalziumfreisetzungseinheiten (CRU) wurde mit 4 µm berechnet. Die Ergebnisse zeigen ferner, dass der Prozess der Kalziumsignal-Übertragung in dem beschriebenen Reaktions-Diffusions-System in einem relativ kleinen Bereich von Diffusionslängen optimal ist. Eine Änderung dieser Strecke um ±2µm bewirkte eine Reduktion der Ausbreitungsgeschwindigkeit um 40%. Es scheint, als wäre der Abstand zwischen den CRU (Cluster von Ryanodin-Rezeptoren) ein empfindlicher Parameter bezüglich der Ausbreitung von Kalziumsignalen. Ein suboptimales Funktionieren des Reaktions-Diffusions-Systems in lebenden Zellen könnte einen negativen Effekt auf die Ausbreitung von intrazellulären Kalziumsignalen und somit auf die Zellfunktion haben.

Calcium plays a central role in cellular signalling cascades. Like other signalling ions or molecules an increase of calcium leads to the activation of specific cell functions. Calcium induced calcium release (CICR) from the membranes of the sarcoplasmatic reticulum (SR) is crucial for the propagation of calcium signals. Vesicles of the SR are involved in the initiation of elementary events like calcium sparks, oscillations and waves. Previous research has shown that clusters of calcium-loaded SR vesicles embedded in an agarose gel behave like an excitable medium propagating spatial-temporal calcium patterns. In a 3D-hexagonal arrangement, the distance between neighboring spheres is constant. SR vesicles can also be regarded as spheres and we therefore postulated the relationship between distance and vesicular protein concentration to be nonlinear. In order to clarify the questioning liquid agarose-gels with embedded SR vesicles were fixed. Electron microscopic documentation did not confirm the expected relationship between inter-SR vesicle distance and vesicular protein concentration. On the contrary under the light microscope we did find protein concentration-dependent arrangements of SR vesicle-clusters, which can be described by a linear function. Stable calcium waves occurred at SR vesicle protein concentrations between 7 and 16.32 mg/ml. The velocities of calcium waves reached speeds of up to 60 µm/s at an optimum SR vesicle protein concentration of 12 mg/ml. The corresponding distance of neighboring calcium release units was calculated to be 4 µm. The results further show that calcium signalling in the described reaction-diffusion system is optimal in a relatively small range of diffusion lengths. A change of ±2µm resulted in a reduction of the propagation velocity by 40%. The distance between calcium release units (clusters of ryanodine receptors) seems to be a sensitive parameter concerning propagation of Ca signals. A suboptimal function of the reaction-diffusion system in living cells might have a negative effect on the spreading of intracellular calcium signals and consequently on the cell’s function.