Cytomics: Strategien von Cupriavidus necator JMP134 beim Umgang mit dem toxischen Substrat Phenol

Abstract

Bakterien haben diverse Adaptationsmechanismen entwickelt, welche ihr Überleben unter Stresssituationen sichern. Herkömmlich erfolgen die Analysen dieser Mechanismen auf Populationsebene. Jedoch befinden sich gewöhnlich nicht alle Zellen einer Population im gleichen metabolischen und physiologischen Zustand. Ähnlich wie tierische oder menschliche Zellpopulationen, sind Bakterienpopulationen heterogen und sollten daher individuell betrachtet werden. In der vorliegenden Arbeit wurde das Verhalten des schadstoff-abbauenden Bakteriums Cupriavidus necator JMP134 bei dessen Konfrontation mit dem toxischen Modellsubstrat Phenol untersucht. Dabei wurden Strategien und Mechanismen, die der Stressbewältigung und Adaptation an zunehmende Phenolkonzentrationen dienen, auf Populations- und individueller Ebene identifiziert. Hierfür wurde eine neue Methode etabliert, mit der Zellen anhand ihrer physiologischen Eigenschaften separiert und deren metabolische Fähigkeiten mit Hilfe der Proteomanalyse näher charakterisiert werden konnte. Die Untersuchungen der Gesamtpopulation haben gezeigte, dass der produktive Abbau eine wichtige Funktion bei der Adaptation an zunehmende Phenolkonzentrationen einnimmt. Dieser wird sichergestellt durch die Induktion zusätzlicher Abbauenzyme und mehrerer Monooxygenasen. Ferner wurde u. a. die verstärkte Expression von periplasmatischen Proteinen, mit Chaperon- und Proteasefunktion, sowie Vertreter der oxidativen Stressantwort detektiert. Mit Hilfe flowzytometrischer Untersuchungen konnte gezeigt werden, dass Zellen innerhalb einer Population unterschiedlich auf zunehmende Phenolkonzentrationen reagieren. Bei Substratrestkonzentration größer 1,7 mM wurde eine neue Subpopulation detektiert. Zellen dieser waren gekennzeichnet durch einen geringeren DNA- und PHB-Gehalt. Durch die Kombination von Flowzytometrie, Zellsortierung und Proteomanalyse erfolgte eine detaillierte Analyse der detektierten Subpopulationen. Diese gezeigte, dass Zellen innerhalb einer Population unterschiedliche Strategien verfolgen. Während ein Teil der Population Wachstum und Vermehrung aufrechterhält, nimmt ein anderer Teil der Population einen dormanten Zustand ein und sichert so Leben und Überleben der Gesamtpopulation für den Fall einer weiteren Zunahme der Stresssituation.

Bacteria have developed different adaptation mechanisms to safe their survival under stress conditions. Usually the analyses of such mechanisms are done with the whole population. But generally cells within a population differ in their metabolic and physiologic status. Bacterial cells are as heterogenic as animal or mammalian cells and should therefore be regarded as individuals. In this thesis the physiological behaviour of the pollutant degrader Cupriavidus necator JMP134 was investigated during its confrontation with the toxic model substrate phenol. Strategies and mechanisms which were used for survival under increasing phenol concentration were investigated on population and individual cell level. For that purpose a new method was used to separate cells based on their physiological status and subsequently investigate their metabolic performance using proteome analysis. The analyses of the whole population have shown that the productive degradation plays a major role in the adaptation on increasing phenol concentrations. This is ensured by the induction of additional degrading enzymes and numerous monooxygenases. Further the increasing expression of periplasmatic enzymes with chaperon and protease function and proteins of the oxidative stress answer were identified. Flow cytometrical investigations revealed that cells in the population react in different ways on increasing phenol concentration. When the residual phenol concentration was higher 1.7 mM a new subpopulation could be detect. This sub-population contains only semi-quantities of DNA and limited ability to synthesize PHB. With the combination of flow cytometry cell sorting and proteome analysis a detailed characterisation of each subpopulation could be achieved. This shown that cells in a population practise different strategies. Whereas one part of the population proliferates, cells of the other part pass over to a dormant state and ensure the survival of the population under increasing stress conditions.