Expression of spider silk and spider silk-like proteins in potato and tobacco

Abstract

Die vorliegende Arbeit beschäftigt sich mit der Herstellung von Spinnenseidenproteinen in transgenen Pflanzen. Eine wichtige Aufgabe dieser Studie bestand darin, das Spinnenseidenprotein FLAG, das für die hohe Elastizität bestimmter Spinnenseiden verantwortlich ist, erstmal rekombinant in transgenen Pflanzen zu produzieren. Zu diesem Zweck wurde ein FLAG-Gen konstruiert, das sowohl N- und C-terminale nichtrepetitive Teile als auch einen repetitiven Teil enthält und daher im Wesentlichen die modulare Struktur des nativen FLAG-Genes widerspiegelt. Ein Ziel dieser Konstruktionen bestand darin, jegliche fremde Detektionssequenzen zu vermeiden. Deshalb wurden nichtrepetitive N- und C-terminale Teile bakteriell exprimiert und als Antigene zur Produktion spezifischerAntikörper benutzt. Spezifische rekombinante Antikörper und spezifische konventionelle Antikörper wurden erzeugt, charakterisiert und zum Nachweis rekombinanter FLAG-Proteine aus Pflanzen genutzt. Die konstruierten FLAG-Genvarianten wurden in Tabakpflanzen exprimiert und TG0-Linien mit hoher FLAG-Produktion identifiziert, die für weitere Untersuchungen zur Verfügung stehen. Eine zweite Aufgabe dieser Arbeit bestand darin, die Stärkekartoffelknolle als Produktionssystem für Spinnenseidenproteine zu testen. Hierzu wurden stabil transformierte transgene Stärkekartoffelpflanzen und transgene Tabakpflanzen erzeugt, die MaSp1-100xELP, MaSp2-100xELP und SO1-100xELP im ER von Blatt- und Knollenzeilen akkumulierten. Das Gesamtknollengewicht von Gewächshauspflanzen wurde von den Wachstumsbedingungen und saisonalen Unterschieden stark beeinflusst. Die so charakterisierten transgenen Stärkekartoffellinien wurden in Freisetzungsversuchen verwendet und charakterisiert. Für die werkstoffmechanische Nutzung ist ein möglichst hohes Molekuargewicht der transgenen Spinneseidenproteine von Vorteil. Ein weiteres Ziel dieser Studie war deshalb, durch posttranslationales Processing das Molekulargewicht von Faserproteinen zu erhöhen. ELP-Immunglobulin-Fc-Fusionsproteine wurden im Endoplasmatischen Retikulum von transgenen Tabakblattzellen akkumuliert und die Bildung von Dimeren nachgewiesen. Für die werkstoffmechanische Charakterisierung ist ein möglichst hohes Molekuargewicht der transgenen Spinneseidenproteine notwendig. Ein weiteres Ziel dieser Studie war, durch posttranslationales Processing das Molekulargewicht von Faserproteinen zu erhöhen. Ein erster Versuch hierzu bestand darin, ein ELP-Immunglobulin-Fc-Fusionsprotein im ER von transgenen Tabakblattzellen zu akkumulieren. Wir konnten zeigen, dass diese Proteine durch Disulfidbrückenbildung wie erwartet Dimere bilden, die unter nichtreduzierenden Bedingungen durch SDS-PAGE und Western blot nachgewiesen wurden. Diese Proteine wurden durch Protein A-Affinitätschromatografie gereinigt und werden hinsichtlich ihrer physikalischen Eigenschaften charakterisiert.

This dissertation deals with the production of spider silk proteins in transgenic plants. The spider silk protein FLAG, responsible for the high elasticity of specific silks, was for the first time produced in transgenic plants. For this purpose, a FLAG gene containing N- and C-terminal non-repetitive parts as well as a repetitive part was constructed. This gene reflects in principle the modular structure of the native FLAG gene. One additional goal of these constructions was to avoid any foreign detection tags. Therefore, non-repetitive N- and C-terminal parts were produced in bacteria and as antigens for the production of specific antibodies. Such specific recombinant and conventional antibodies were produced, characterized and used for the detection of FLAG proteins from plants. The constructed FLAG gene variants were expressed in tobacco plants and TG0 lines with high FLAG production ready for further investigations were identified. A second task of this dissertation was to test starchy potatoes as production system for spider silk proteins. For this purpose, stably transformed starchy potato and tobacco plants accumulating the spider silk proteins MaSp1-100xELP, MaSp2-100xELP and SO1-100xELP in the Endoplasmic reticulum of leaf and tuber cells were produced. The tuber weight of greenhouse plants was strongly influenced by growth and seasonal conditions. The characterized starchy potato lines were used in field trials. For the use of spider silk proteins in material research a high molecular weight is beneficial. Therefore, a further goal of this study was to increase the molecular weight of fiber proteins by posttranslational processing. ELP-immunoglobulin-Fc fusion proteins were accumulated in the Endoplasmic reticulum of transgenic tobacco leaf cells and dimers were identified. Fc-100xELP fusion proteins were purified using the protein A affinity chromatography method. The purified proteins are under investigation now according their structural and physical properties.