Investigations on the optimization of the soluble production of heterologous proteins in Escherichia coli

Abstract

In dieser Doktorarbeit wurde die Produktion des löslichen Proteins Tissue type plasminogen aktivator variante (rPA) im Periplasma von E.coli und Fermentationsmedium mit Hilfe der Thiol-oxidase DsbA in den Erlenmeyerkolben und Fed-batch Kultivierung untersucht. Die Einflüsse der Koexpression von DsbA, verschiedenen Zusatzstoffen (L-Arginin, Redox system, Glycin und Triton X-100) und die Bedingungen für die Lokalisierung von rPA im Periplasma und Fermentationsmedium wurden ermittelt. Unter Verwendung des Dynamic Light Scattering (DLS) konnten die Auswirkungen der Produktionsbedingungen auf die Größe der Einschlusskörper (inclusion bodies-IBs) von α-Glucosidase im Cytolasma von E.coli und auf die Löslichkeit der Proteine ermittelt werden. Die Korngrößenverteilungen der IBs unter verschiedenen Kultivierungsbedingungen, wie z.B: verschiedene Medien, Temperatur, Batch und Fed-batch Kultivierung auf verschiedene Temperaturen wurden analysiert durch DLS. Die Überproduktion von mehreren molekularen Chaperone z.B. DnaK und ClpB in E. coli, die Auswirkungen von Chaperonen auf die Bildung der aggregierende Proteine, Löslichkeit der IBs und das Verhältnis von Aktivität der α-Glucosidase auf die Größe der IBs wurden ebenfalls überprüft.

In this thesis, production of the soluble protein tissue-type plasminogen activator variant (rPA) in the periplasm and culture supernatant with the assistance of thiol oxidase DsbA as a coexpressed helper protein in shake flask and fed-batch cultivation was investigated. The influences of coexpression of DsbA, different additives (L-arginine, redox system, glycine and Triton X-100) and fermentation conditions on the localization of rPA in the periplasm and culture supernatant were investigated. Besides that, a new technique Dynamic Light Scattering (DLS) using the Zetasizer 3000 (Malvern, UK) was applied to determine the impact of production conditions on the size of inclusion bodies (IBs) of α-glucosidase in cytolasm of E.coli and on the protein solubility. Size distributions of IBs of α-glucosidase under various cultivation conditions such as: different media, temperature, batch and fed-batch cultivation at different temperature were analysed by DLS. By overproduction of several molecular chaperones e.g. DnaK and ClpB in E. coli, effects of those chaperones on aggregated protein formation, resolubilization of α-glucosidase IBs and the relation of α-glucosidase activity to the size of the IBs were also studied.