Regulation der ADP-Rezeptor-abhängigen Phosphorylierung von Proteinen an Tyrosinresten in humanen Thrombozyten

Abstract

In Thrombin stimulierten Thrombozyten ändert sich das Muster der Phosphorylierung an Tyrosinresten bei einer Reihe von Proteinen. In dieser Arbeit waren die Signalwege der G-Protein gekoppelten ADP-Rezeptoren P2Y1 und P2Y12 von besonderem Interesse. Dafür wurden Thrombozyten aus dem Vollblut freiwilliger Spender gewonnen und nach verschiedenen Aktivierungsexperimenten mittels Western-Blot die an Tyrosinresten phosphorylierten Proteine untersucht. Außerdem wurden Aggregationsmessungen im Aggregometer durchgeführt. Nach einem primären Stimulus, zum Beispiel durch Thrombin, kommt es zur Degranulation und anschließend zur autokrinen Stimulation der Thrombozyten durch die freigesetzten Substanzen, unter anderem auch ADP. Es konnte gezeigt werden, dass dabei eine Reihe von Proteinen an Tyrosinresten phosphoryliert werden. Nach Inhibierung des P2Y12-Rezeptors mit einem spezifischen Antagonisten werden die Tyrosinphosphorylierungen von zwei Proteinen der relativen Molmasse von 27 und 31 kDa verhindert. Die Signale des P2Y1-Rezeptors haben jedoch keinen Einfluss auf diese Phosphorylierungen an Tyrosinresten. In weiteren Untersuchungen wurde gezeigt, dass es sich hierbei nicht um ein Phänomen handelt, das an die Aggregation gebunden ist. Experimente mit verschiedenen Substanzen brachten weiteren Aufschluss über intrazelluläre Signaltransduktionswege, insbesondere auf der Ebene der G-Proteine. Außerdem wurden die Effekte der Adenylatzyklase und der Phosphoinositol-3-Kinase auf die genannten Phosphorylierungen untersucht. Mit den Daten dieser Arbeit wurde gezeigt, dass die Änderungen der Phosphorylierungen an Tyrosinresten einiger Proteine in humanen Thrombozyten sowohl von einem primären Stimulus, als auch durch die Degranulation induzierten sekundären Signale inhibitorischer G-Proteine abhängig sind.

In thrombin-stimulated human plateletes several proteins undergo rapid and transient changes in tyrosine phosphorylation. In our studies the main interest was focused on the intracellular signal transduction pathways downstream the two G-protein-coupled ADPreceptors P2Y1 and P2Y12. Suspension of washed human platelets were prepared from whole blood of healthy volunteers and stimulated with different agonists. Tyrosine phosphorylation was determined with immunoblotting. The extent of aggregation was measured in an aggregometer. After a primary signal, for example thrombin, many substances are releases from dense granules. Once released, for example ADP and other substances stimulate their receptors on the platelet's surface. Downstream these signal transduction cascade a variety of proteins are tyrosine phosphorylated. It was shown that specific antagonists of the P2Y12-ADP-receptor inhibit tyrosine phosphorylations of two proteins of a molecular weight of 27 and 31 kDa. Antagonists of the P2Y1-receptor have no effect. Moreover it was demonstrated that this phenomenon is not related to platelet's aggregation. Further investigations gave deeper insight in intracellular signal transduction on the G-protein level. In addition, the effects of phosphatidylinositol-3-kinase and adenylylcyclase on the tyrosine phosphorylation of p27 and p31 were studied. These data indicate that the observed changes of tyrosine phosphorylation are the result of a primary stimulus, for example thrombin, and on G-proteins-receptor coupled secondary signals as well.