Tetrahydrofuran-Katabolismus in Pseudonocardia sp. Stamm K1: Molekularbiologische und biochemische Charakterisierung einer Mehrkomponenten-Monooxygenase und einer Succinatsemialdehyd-Dehydrogenase

Abstract

In Pseudonocardia sp. Stamm K1 wurde ein Gencluster identifiziert, das für Enzyme des Tetrahydrofuran (THF)-Katabolismus kodiert. Nach Sequenzierung und Analyse des 9,2 kb DNA-Fragmentes wurden 10 offene Leserahmen identifiziert. Die Gene thmADBC kodieren für die Komponenten einer putativen THF-Monooxygenase, deren Aminosäuresequenzen signifikante Ähnlichkeiten zu Mehrkomponenten-Monooxygenasen mit binuklearem Eisenzentrum aufweisen. ThmA kodiert für die α -Untereinheit der Oxygenase (545 Aminosäuren), thmB für die β-Untereinheit der Oxygenase (346 Aminosäuren), thmC für das Kopplungsprotein (117 Aminosäuren) und thmD für die Reduktase-Komponente (360 Aminosäuren). In THF-gewachsenen Zellen konnte eine spezifisch induzierte Reduktase identifiziert werden. Es konnte gezeigt werden, daß das isolierte Enzym durch thmD kodiert wird und ein kovalent gebundenes Flavin als Kofaktor besitzt. Stromaufwärts der Monooxygenase-Gene wurde ein weiterer offener Leserahmen (thmS) identifiziert. Die aus thmS ableitbare Aminosäuresequenz zeigte signifikante Ähnlichkeiten zu verschiedenen Aldehyd-Dehydrogenasen. In THF-gewachsenen Zellen wurde eine THF-induzierte Succinatsemialdehyd-Dehydrogenase-Aktivität detektiert. Nach Isolierung und Charakterisierung des entsprechenden Enzyms konnte gezeigt werden, daß dieses vom Gen thmS kodiert wird. Die Transkription von thmADBC und thmS wird durch THF spezifisch induziert. Es konnten mono-, bi- und polycistronische Transkripte nachgewiesen werden. Mit Hilfe von primer extension-Experimenten wurde der Transkriptionsstartpunkt stromaufwärts von thmS, thmA und thmB bestimmt. Weiterhin wurden stromaufwärts von thmS der offener Leserahmen orfY und stromabwärts von thmC drei offene Leserahmen (orfQ, orfZ und thmH) identifiziert. Das in dieser Arbeit analysierte Gencluster ist in der Gesamt-DNA von Pseudonocardia sp. Stamm K1 nur einmal vorhanden und auf einem zirkulären Plasmid von etwa 60 kb lokalisiert.

A gene cluster encoding enzymes involved in the utilization of tetrahydrofuran (THF) by Pseudonocardia sp. strain K1 was cloned and sequenced. Analysis of a 9,2 kb DNA fragment revealed 10 open reading frames. The genes designated as thmADBC encode the components of a putative THF monooxygenase exhibiting a high similarity to different binuclear iron-containing multicomponent monooxygenases. ThmA encodes the 545 amino acid oxygenase α-subunit, thmB the 346 amino acid oxygenase β-subunit, thmC the small 117 amino acid coupling protein, and thmD the 360 amino acid reductase component. A specifically induced reductase could be identified in THF-grown cells. After purification and characterization of this enzyme it could be shown that it is encoded by thmD and has a covalently bound flavin as cofactor. Upstream of the monooxygenase genes an additional open reading frame was identified (thmS) coding for a protein with high similarity to various aldehyde dehydrogenases. A succinate semialdehyde dehydrogenase activity was specifically expressed in THF-grown cells. N-terminal sequence analysis of the purified protein revealed that it is encoded by thmS. Nothern-blot analysis indicated that transcription of thmADBC and thmS was specifically induced during growth on tetrahydrofuran. Mono-, bi-and polycistronic transcripts of theses genes were detected including mRNAs comprising both enzymes. Primer extension analysis has identified transcriptional start sites upstream of the translation start of thmS, thmA and thmB. Additional open reading frames were identified upstream of thmS (orfY) und downstream of thmC (orfQ, orfZ and thmH). The data indicated that the analyzed gene cluster was present as a single copy and located on a circular plasmid of at least 60 kb.